柳氮磺胺吡啶中一个杂质的结构测定

姚旭波 沈莉 许爱红

（上海中西三维药业有限公司 上海 200331）

柳氮磺胺吡啶（sulfasalazine，1）作为一个使用历史悠久的传统药，有抗炎和抗菌的双重作用，口服后很少吸收，在肠壁中分解起治疗作用，多用于溃疡性结肠炎的治疗[1-2]。近年的许多资料表明，它还能抑制免疫复合物及类风湿因子的合成，从而对类风湿关节炎的免疫病理损伤发生影响[3-5]。该药用于治疗炎性肠病及类风湿关节炎已有40多年的历史。20世纪70年代后期的试验证明，该药可改善类风湿关节炎的临床症状并能使C反应蛋白和血沉有不同程度下降[6-7]。

柳氮磺胺吡啶是由磺胺吡啶和水杨酸经重氮偶合反应而合成的（图1）。

图1 1的合成路线

基于自由基机理的重氮偶合反应复杂、副产物多，因此柳氮磺胺吡啶成品所含杂质比较多，且通过后期的精制方法很难去除。我们在对本公司生产的柳氮磺胺吡啶原料药杂质进行研究时，发现其中一个未知杂质的含量在0.06%～0.08%之间。根据人用药物注册技术要求国际协调会议（ICH）技术指导原则的要求，对于柳氮磺胺吡啶这个日服用量超过6 g、未知杂质超过0.05%的药品必须确认结构。所以，我们分离提纯了这个杂质（2），并确定其结构。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

AV500型核磁共振仪和micrOTOF II质谱仪（瑞士Bruker公司）；Agilent 1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司）。

1.2 试剂

1（上海中西三维药业有限公司，批号201204045，纯度97.7%）；薄层色谱硅胶H（青岛海洋化工厂出品）；甲醇为色谱纯，其它试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 有关物质的分离与制备

2.1 色谱条件

按照欧洲药典EP7.7标准中的有关物质分析方法分析。色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶（5 μm）为固定相的不锈钢柱，柱长25 cm×4.6 mm。检测波长320 nm，流速1.0 ml/min，柱温25 ℃，进样量20 µl。流动相A：pH 4.8的磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钠1.13 g和醋酸钠2.5 g，加水900 ml，用冰醋酸调pH至4.8，并用水稀释至1 000 ml）；流动相B：流动相A-甲醇(10：40，v/v)的混合液。洗脱条件见表1。

表1 柳氮磺胺吡啶有关物质液相色谱流动相洗脱条件

2.2 方法与结果

取1适量，用稀氨溶液（氨水7.8 ml，加水稀释至1 000 ml）配制浓度为1 mg/ml的供试品溶液，进样量20 µl，记录色谱图。在上述色谱条件下，1主峰保留时间为23.070 min，杂质2的保留时间为15.862 min（图2）。

2.3 2的分离制备

取我公司柳氮磺胺吡啶的精制母液，溶剂经旋转蒸发浓缩至褐色黏稠液。取5 g溶于100 ml氯仿-丙酮-甲酸（60：20：2）的混合液中，再加入10 g薄层色谱硅胶H粉，混匀，置旋转蒸发仪上蒸除混合溶剂，得吸附了样品的混合硅胶H湿粉。将此湿粉放入鼓风烘箱内烘干，得吸附了样品的棕黄色混合硅胶H干粉，重约13 g。将此混合硅胶H干粉加入已装有薄层色谱硅胶H的色谱柱（5 cm×60 cm）中，用氯仿-丙酮-甲酸（60：20：2）洗脱（必要时可增加甲酸的比例），并用硅胶薄层色谱（以氯仿-丙酮-甲酸=60：30：5为展开剂，在紫外光254 nm下检视）跟踪检测洗脱液，收集Rf值约为0.45的洗脱液，将其中的溶剂蒸发除尽，得棕色油状物2的粗品。该粗品中尚混有残余的柳氮磺胺吡啶（Rf值约为0.7），需按上述方法经过反复几次柱层析，才能去除柳氮磺胺吡啶。最后得到浅黄色粉末状固体2，HPLC含量为99.3%。

图2 柳氮磺胺吡啶的有关物质色谱图

3 杂质2的结构解析

2在ESI质谱条件下的质谱主峰为m/z 482.096 2[M+H]+，与推测的分子式为C22H19N5O4S2的分子量481.087 8相符，可以确定2的分子式为C22H19N5O4S2。

从核磁共振氢谱和碳谱可以看出该结构是完全对称的结构（表2），存在两个对位取代的苯环和两个类似于吡啶环的结构。

表2 2的1H NMR、13C NMR和2D相关谱数据

在1H-1H COSY实验中，δH7.74和δH7.18相关，这8个氢可以确定为两个对位取代苯环上的氢；δH8.03与δH6.85相关，δH6.85同时又与δH7.66相关，δH7.66同时和δH7.09相关，根据化学位移和耦合常数规律，可以确定δH8.03为芳香环上N邻位的氢，即为H-6,6’，δH6.85 归属为 H-5,5’，δH7.66 归属为 H-4,4’，δH7.09 归属为 H-3,3’。

HSQC实验中，δH9.16和δH11.60的氢没有对应的相关碳的信号，可以确定为活泼氢的信号。δH9.16归属为H-14, δH11.60归属为H-13,13’，谱图中δH11.60的峰积分值偏小，是因为这个峰比较宽导致积分值不准确。

NOESY实验中δH9.16和δH7.18相关，可以确定δH7.18 为 H-9,9’,11,11’的信号 , 而 δH7.74 就可以确定为H-8,8’,12,12’的信号。

HSQC实验中，δH7.74与δC128.47相关，δC128.47归属为 C-8,8’,12,12’； δH7.18 与 δC116.27 相关，δC116.27 归属为 C-9,9’,11,11’； δH8.03 与 δC144.74 相关，δC144.74 归属为 C-6,6’； δH6.85 与 δC115.88 相关，δC115.88归属为C-5,5’；δH7.66与δC139.36相关，δC139.36归属为 C-4,4’；δH7.09与 δC113.06相关，δC113.06 归属为 C-3,3’。

HMBC 实验中，δH7.66和 δH8.03与 δC153.14相关，δC153.14归属为 C-2,2’；δH7.74与δC145.33相关，δC145.33归属为 C-10,10’；δH7.18与 δC132.75相关，δC132.75 归属为 C-7,7’。

综合以上信息，将2的结构解析为双{4-[(2-亚氨基吡啶-1(2H)-基)磺酰]苯基}胺（图3）。

致谢

本文中的质谱委托复旦大学检测，核磁共振谱委托上海医药集团中央研究院检测，结构解析得到了上海睿智化学研究公司的帮助，特此鸣谢。

图3 2的化学结构

[1] Sircar JC, Schwender CF, Carethers ME. Inhibition of soybean lipoxygenase by sulfasalazine and 5-aminosalicylic acid: a possible mode of action in ulcerative colitis[J].Biochem Pharmacol, 1983, 32(1): 170-172.

[2] 濮永杰, 柳汝明, 唐尧. 奥沙拉嗪与柳氮磺吡啶治疗溃疡性结肠炎疗效与安全性的系统评价[J]. 中国药房, 2010,21(20): 1899-1902.

[3] Neumann VC, Grindulis KA. Sulfasalazine in rheumatoid arthritis: an old drug revived[J]. J R Soc Med, 1984, 77(3):169-172.

[4] Pullar T. Sulfasalazine and related drugs in rheumatoid arthritis [J]. Pharmacol Ther, 1989, 42(3): 459-468.

[5] Weinblatt ME, Reda D, Henderson W,et al. Sulfasalazine treatment for rheumatoid arthritis: a metaanalysis of 15 randomized trials [J]. J Rheumatol, 1999, 26(10): 2123-2130.

[6] 王鸣军, 陈志伟, 沈月平, 等. 来氟米特与柳氮磺吡啶治疗强直性脊柱炎疗效观察[J]. 苏州大学学报（医学版）,2008, 28(2): 277-279.

[7] Chen J, Liu C. Is sulfasalazine effective in ankylosing spondylitis? A systematic review of randomized controlled trials[J]. J Rheumatol, 2006, 33(4): 722-731.