辛伐他汀对apoE－/－小鼠HDL抗炎抗氧化功能的影响

田迪，秦亚飞，应如，谭迎，冯力，袁勇，赖文岩，郭志刚

动脉粥样硬化性疾病是目前全球死亡的主要原因之一。目前认为氧化应激和炎症在动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的发生发展过程中具有重要作用[1]，抗炎抗氧化在抗动脉粥样硬化过程中具有重要意义。研究已证实高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)除具有促胆固醇逆转运作用外，还有抗炎抗氧化的功能[2]，改善HDL抗炎抗氧化功能可延缓动脉粥样硬化进展。血清屏氧酶1(paraoxonase 1，PON1)活性、髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性和HDL炎症指数(highdensity lipoprotein inflammatory index，HII)这3个指标可准确反映HDL的抗炎抗氧化功能[2]，国外研究曾报道冠心病患者血清PON1活性明显下降[3]，HII明显升高[4]，而关于反映载脂蛋白A-I(apoA-I)损伤程度的血清MPO活性及联合检测上述3个指标的研究目前国内外尚未见报道。

辛伐他汀作为目前临床常用的他汀类调脂药物之一，具有减轻动脉粥样硬化[5]、稳定斑块、减少心血管事件[6]、抑制心肌梗死后心室重构[7]的作用。研究已证实其抗动脉粥样硬化的主要机制在于降低低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoproteincholesterol，LDL-C)水平，而且具有轻度升高高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)的作用[8]，但其是否对HDL的抗炎抗氧化功能具有影响目前国内鲜见报道。本实验采用apoE－/－小鼠动脉粥样硬化小鼠模型，检测其血清PON1活性、MPO活性、HII以及其他相关指标，研究辛伐他汀对HDL抗炎抗氧化功能的影响，以进一步探讨辛伐他汀抗动脉粥样硬化的作用机制。

图1 动物干预流程图Fig. 1 Flow chart of experimental protocol of interventions

1 材料与方法

1.1 材料 8周龄健康雄性apoE－/－小鼠购自北京大学医学部实验动物科学部，同龄健康雄性C57BL/6J小鼠购自南方医科大学动物实验中心，普通饲料和高脂饲料(含21%猪油、0.15%胆固醇)[9]均购自广东省医学实验动物中心。辛伐他汀购自杭州默沙东制药有限公司，乙酸苯酯购自美国Sigma公司，血清MPO活性测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所，小鼠高敏C反应蛋白(high sensitive C reactive protein，hs-CRP)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司(Cusabio)。AU-5421型生化自动分析仪、BX51型电子显微镜及图像采集系统购自日本Olympus公司，Universal 16R型低温冷冻高速离心机购自美国Hettich公司，ND-1000 Spectrophotometer型分光光度仪购自美国NanoDrop公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及干预 18只8周龄C57BL/6J小鼠给予普通饲料喂养，作为对照组，30只8周龄apoE－/－小鼠给予高脂饲料喂养，喂养4周后随机乙醚麻醉处死两组小鼠各6只，检测相应指标作为研究基线(第4周)。其余24只apoE－/－小鼠随机分为动脉粥样硬化组(AS组，n=12)和辛伐他汀组(n=12)，剩下的12只C57BL/6J小鼠仍作为对照组。对照组和AS组小鼠继续原饲料喂养，辛伐他汀组在高脂饲料喂养基础上给予辛伐他汀5mg/(kg·d)灌服，对照组和AS组小鼠给予等体积生理盐水灌服，第8、16周后，分别处死3组小鼠(每组每个时间点6只)并测定相应指标。动物干预流程如图1所示。

1.2.2 血脂测定 实验第4、8、16周末，在空腹12h状态下麻醉小鼠后心脏采血，3000r/min离心10min，留取血清，－80℃冰箱保存备用。采用酶法在日本日立76002020全自动生化仪上测定血清总胆固醇(total cholesterol，TC)、LDL-C、HDL-C、甘油三酯(triglyceride，TG)含量。

1.2.3 血清PON1活性测定 采用Rozenberg等[10]的分光光度法测定血清PON1活性：取反应缓冲液(CaCl22mmol/L，Tris-HCl 0.1mol/L，pH8.0)1.3ml，加入5mmol/L乙酸苯酯150μl，于25℃预温20min后，加入1:10倍稀释的样本血清50μl(稀释液为反应缓冲液)，反应90s，用0.5mol/L EDTA 100μl终止反应。然后用分光光度计于270nm波长处测定吸光度(A)值。同时设立血清对照和底物对照。酶活性计算公式：PON1活性=A×f×FV×103/(t×SV×L×ε)。A为净吸光度值(即标本A值－血清对照和底物对照的A值)，f为标本稀释倍数，FV为反应终体积，t为反应时间，SV为样品体积，L为光径，ε为摩尔消光系数，270nm波长处乙酸苯酯的ε=1310L/(mol·cm)。酶的活性单位(U)定义为每分钟催化1μmol乙酸苯酯水解所需的酶量。

1.2.4 血清MPO活性测定 血清MPO活性根据南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书进行测定。酶活力单位定义：每升血清在37℃反应体系中分解1μmol H2O2为1个酶活力单位。计算公式：MPO(U/L)=(测定管A值－对照管A值)/[11.3×取样量(L)]。

1.2.5 血清hs-CRP含量测定 小鼠血清hs-CRP含量采用酶联免疫分析法(ELISA)检测，具体操作严格根据武汉华美生物工程有限公司(Cusabio)提供的小鼠试剂盒说明书进行。

1.2.6 血清HII测定 血清HII采用非细胞学法[4]测定：10μl葡聚糖硫酸酯与100μl血清混合后8000×g离心10min，上清仅含HDL-C(无LDL-C和VLDLC)，用胆固醇试剂盒测定上清胆固醇量，调整胆固醇终浓度为10μg/ml；将2,7-二氢二氯荧光黄双乙酸钠(DCFH-DA)溶于新鲜甲醇(终浓度2mg/ml)，室温下避光孵育30min，制成2,7-二氢二氯荧光黄(DCFH)溶液；将1-棕榈酰-2-(5,6-环氧异前列腺素E2)锡甘油-3-磷酸胆碱溶液(PEIPC，终浓度为50μg/ml)10μl和含HDL的上清液90μl在黑聚苯乙烯微盘中混合，并放入37℃烤箱中孵育1h；再在微盘的每个孔中加入10μl DCFH溶液(0.2mg/ml)混合，放入37℃烤箱中孵育2h；用荧光分析仪分析荧光强度(激发波长为485nm，发射波长为530nm，终止波长为515nm)，如数值小于1，则判断HDL颗粒有抗炎作用，如数值大于1，则判断为有促炎作用(HDL缺乏时，将PEIPC氧化DCFH所形成的荧光强度标准化为数值1)。

1.2.7 主动脉斑块面积测量 心脏采血后，在大体显微镜下从升主动脉起始部至髂动脉分叉处分离小鼠主动脉，然后纵行剖开主动脉，采用油红O染色主动脉内膜斑块，拍照后应用Image-plus 6.0图像分析软件分析主动脉斑块/血管内膜表面积比例。

1.3 统计学处理 所有计量资料均以x±s表示，并采用SPSS 13.0统计软件进行两样本均数比较的独立样本t检验，多组间总体均数比较在方差齐时采用单因素方差分析，方差不齐时采用Welch校正检验，多个样本均数间的多重比较方差齐时采用LSD-t检验，方差不齐时采用Dunnett's T3检验，相关性分析采用Spearman相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组小鼠血脂水平的变化 对照组第4、8、16周TC、TG、LDL-C、HDL-C水平比较无明显变化；与4周比较，AS组小鼠给予高脂饲料8、16周后TC、TG、LDL-C水平均明显升高(P＜0.05或P＜0.01)。AS组各时间点TC、TG、LDL-C水平与同时间点对照组比较均明显升高(P＜0.05或P＜0.01)。第8周时，辛伐他汀组TC、TG水平与AS组比较明显下降(P＜0.05或P＜0.01)，而LDL-C、HDL-C无明显变化。第16周时，辛伐他汀组TC、TG、LDL-C水平与AS组比较均明显降低(P＜0.05或P＜0.01)，但仍高于对照组(P＜0.01)，而HDL-C水平与AS组比较明显升高(P＜0.05，表1)。

2.2 辛伐他汀对apoE－/－小鼠血清PON1活性、MPO活性、HII及hs-CRP含量的影响 与第4、8周时比较，第16周时对照组小鼠血清PON1活性明显降低(P＜0.01)，MPO活性无明显变化，HII、hs-CRP含量明显升高(P＜0.05或P＜0.01)。随时间进展，AS组小鼠PON1活性逐渐降低，MPO活性、hs-CRP含量和HII均逐渐升高。AS组小鼠血清PON1活性在4周时与对照组比较无明显差异，8、16周时则明显低于对照组(P＜0.01)；MPO活性、hs-CRP、HII水平在4周时与对照组比较无明显差异，8、16周时均明显高于对照组(P＜0.01)。第8、16周时辛伐他汀组小鼠血清PON1活性均高于AS组(P＜0.01)，但低于对照组(P＜0.01)；hs-CRP含量均低于AS组，8周时与对照组比较无明显差异，而16周时高于对照组(P＜0.01)；MPO活性和HII均低于AS组，但高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01，表2)。

2.3 主动脉斑块/血管内膜表面积比值 油红O染色后拍照并分析主动脉弓至胸主动脉斑块/血管内膜表面积比值，结果显示AS组主动脉斑块/血管内膜表面积比值随时间进展逐渐增加，且明显高于同期对照组(4周：9.90%±1.90% vs 2.24%±0.47%，P＜0.01；8周：33.23%±7.12% vs 2.45%±0.36%，P＜0.01；16周：44.30%±11.85% vs 2.54%±0.25%，P＜0.01)；辛伐他汀组16周时主动脉斑块/血管内膜表面积比值(19.77%±1.95%)与8周时(13.79%±2.01%)比较明显增加(P＜0.01)，但均低于同时间点AS组，差异有统计学意义(P＜0.05，图2)。

表1 实验第4、8、16周各组小鼠血脂水平比较(mmol/L，±s，n=6)Tab.1 Comparison on serum lipid levels among the three groups at 4, 8, 16 weeks (mmol/L,±s, n=6)

表1 实验第4、8、16周各组小鼠血脂水平比较(mmol/L，±s，n=6)Tab.1 Comparison on serum lipid levels among the three groups at 4, 8, 16 weeks (mmol/L,±s, n=6)

(1)P＜0.01, (2)P＜0.05 compared with control group; (3)P＜0.01, (4)P＜0.05 compared with AS group; (5)P＜0.01, (6)P＜0.05 compared with 4 weeks; (7)P＜0.01, (8)P＜0.05 compared with 8 weeks

Time point TC TG LDL-C HDL-C 4 weeks Control 3.27±0.27 0.71±0.17 0.44±0.10 2.41±0.38 AS 14.64±1.16(1) 1.84±0.27(1) 8.10±0.95(1) 2.96±0.46(2)8 weeks Control 3.52±0.41 0.79±0.14 0.53±0.11 2.46±0.21 AS 16.40±2.04(1) 2.31±0.34(1)(6) 9.32±1.18(1) 2.62±0.32 Simvastatin 11.78±1.57(1)(3) 1.96±0.12(1)(4) 8.13±1.81(1) 2.90±0.37(2)16 weeks Control 3.17±0.53 0.91±0.32 0.55±0.10 2.27±0.32 AS 22.42±1.99(1)(5)(7) 2.68±0.28(1)(5)(8) 12.45±1.29(1)(5)(7) 1.60±0.22(1)(5)(7)Simvastatin 14.89±2.06(1)(3)(8) 2.34±0.17(1)(4)(7) 7.59±1.25(1)(3) 2.03±0.40(4)(7)

表2 各组小鼠血清PON1活性、MPO活性、HII、hs-CRP水平(s, n=6)Tab. 2 Serum PON1 and MPO activity, HII and hs-CRP levels of the three groups ±s, n=6)

表2 各组小鼠血清PON1活性、MPO活性、HII、hs-CRP水平(s, n=6)Tab. 2 Serum PON1 and MPO activity, HII and hs-CRP levels of the three groups ±s, n=6)

(1)P＜0.01, (2)P＜0.05 compared with control group; (3)P＜0.01, (4)P＜0.05 compared with AS group; (5)P＜0.01, (6)P＜0.05 compared with 4 weeks; (7)P＜0.01, (8)P＜0.05 compared with 8 weeks

Time point PON1 (U/ml) MPO (U/L) HII hs-CRP (ng/ml)4 weeks Control 126.32±7.52 27.52±3.00 0.58±0.12 96.30±20.32 AS 121.13±9.50 31.14±3.21 0.72±0.11 116.76±16.15 8 weeks Control 124.89±6.98 29.84±2.92 0.61±0.07 110.06±14.39 AS 100.11±7.72(1)(5) 50.47±3.12(1)(5) 0.99±0.11(1)(5) 141.39±10.25(1)(5)Simvastatin 116.18±6.74(3) 39.07±3.17(1)(3) 0.81±0.09(1)(3) 118.79±15.98(4)16 weeks Control 103.66±10.26(5)(7) 30.84±3.12 0.79±0.09(5)(7) 132.19±15.35(5)(8)AS 48.03±6.47(1)(5)(7) 56.30±3.77(1)(5)(7) 1.33±0.11(1)(5)(7) 236.09±18.87(1)(5)(7)Simvastatin 63.39±5.96(1)(3)(7) 43.20±6.66(2)(3) 0.96±0.09(1)(3)(8) 193.59±27.58(1)(3)(7)

图2 实验16周后3组小鼠主动脉斑块面积(油红O染色)Fig. 2 The percentage plaque area of the three groups at 16 weeks (oil red O staining)A. Control group; B. AS group; C. Simvastatin group

2.4 相关性分析 将血清PON1活性、MPO活性、HII、hs-CRP含量与主动脉斑块/血管内膜表面积比值进行相关性分析，结果显示小鼠血清PON1活性与主动脉斑块/血管内膜表面积比值呈显著负相关(r=－0.679，P＜0.01)，MPO活性、HII、hs-CRP与主动脉斑块/血管内膜表面积比值均呈显著正相关(r值分别为0.893、0.813、0.701，P＜0.01)。

3 讨 论

本研究中，高脂饲养组的apoE－/－小鼠血脂水平明显升高，主动脉油红O染色可见明显斑块形成，提示动脉粥样硬化小鼠模型造模成功。

辛伐他汀是一种3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A，HMG-CoA)还原酶抑制剂，目前已明确其具有降低LDL-C及轻度升高HDL-C的作用[8]。本研究中与动脉粥样硬化组比较，经辛伐他汀干预后小鼠血清TC、LDL-C水平均明显降低，同时血清HDL-C水平升高，与相关研究结果一致[11]。

PON1活性、MPO活性、HII均为准确反映HDL抗炎抗氧化功能的特异性指标，虽然国外学者曾报道冠心病患者血清PON1活性明显下降[3]，HII明显升高[4]，但反映apoA-I损伤程度的血清MPO活性目前国内外鲜有研究。本研究在动物实验中联合检测上述3个指标，可准确反映HDL的抗炎抗氧化功能以及辛伐他汀对HDL抗炎抗氧化功能的影响。

PON1是HDL重要的抗氧化酶之一，与HDL的抗氧化、抗动脉粥样硬化作用密切相关。由于PON1必须与apoA-I结合才能发挥抗氧化功能，所以PON1的血清浓度不能完全反映HDL抗氧化功能的强弱，而其活性才能更好地反映HDL的抗氧化功能[12]。Graner等[13]研究发现冠心病组PON1活性及浓度明显高于正常对照组，且其活性及浓度与冠脉病变严重程度相关。本研究也发现AS组血清PON1活性较对照组明显下降，而辛伐他汀干预后apoE－/－小鼠血清PON1活性较AS组明显升高，提示辛伐他汀可能有助于升高血清PON1活性，从而改善HDL的抗氧化功能。

MPO是一种由中性粒细胞、单核巨噬细胞等产生的强致氧化性酶，可氧化修饰血液循环和组织中的apoA-I，其色氨酸、酪氨酸、赖氨酸和甲硫氨酸残基被氧化修饰后可发生结构改变，从而影响其与ATP结合盒转运子A1(ATP binding cassette transporter A1，ABCA1)的结合，进而影响HDL经ABCA1途径的促胆固醇逆转运及抗炎抗氧化功能[14]。本研究中AS组血清MPO氧化活性较对照组显著升高，提示其HDL的正常功能受到损害，而辛伐他汀组血清MPO活性较AS组明显降低，表明辛伐他汀可降低血清MPO活性，改善HDL的抗炎抗氧化功能。

AS是以血管壁慢性炎症为特征的病理过程。正常情况下HDL可促进胆固醇逆转运，抑制LDL的氧化修饰，减少炎症因子产生，从而发挥抗炎功能，而在AS状态下，HDL并没有抗AS作用，甚至还可促进血管壁的炎症反应。有研究表明冠心病患者HDL炎症指数明显高于正常对照组，HDL功能处于致炎状态[4]。Navab等[15]研究发现，冠心病患者接受辛伐他汀(40mg/d)治疗6周后HII即明显下降。本研究也得到了相似的结果，再次证明辛伐他汀可降低HII，促使HDL由致炎状态向抗炎状态转变。

C反应蛋白(CRP)是目前研究最多的AS相关炎性生物标志物，尽管CRP是一种急性期反应产物，由肝细胞在感染、损伤等应激条件下受IL-6诱导合成，但参与了AS形成的全过程，其血浆水平升高高度提示存在AS风险。流行病学资料表明血清或血浆中CRP水平升高与AS密切相关，是AS的独立预测因素[16]。在本研究中，AS组血清hs-CRP水平较对照组明显升高，而辛伐他汀治疗后其血清水平显著下降，与主动脉斑块/血管内膜表面积比值这一AS金标准的测定结果一致，进一步表明辛伐他汀可抑制炎症反应，进而发挥抗AS作用。

综上所述，辛伐他汀除降低LDL-C、升高HDL-C水平外，还可通过升高PON1活性、降低MPO活性、降低HII、抑制炎症反应等途径改善HDL的抗炎抗氧化功能，从而减少主动脉内膜斑块面积，发挥抗AS作用。本研究结果提示辛伐他汀不仅是一种降低LDL-C、升高HDL-C水平的调脂药物，而且具有改善HDL功能的作用，后者也应该受到我们的重视。

[1] Berliner JA, Navab M, Fogelman AM, et al. Atherosclerosis:basic mechanisms: oxidation, inflammation and genetics[J].Circulation, 1995, 91(9): 2488-2496.

[2] Ansell BJ, Watson KE, Fogelman AM, et al. High-density lipoprotein function recent advances[J]. J Am Coll Cardiol,2005, 46(10): 1792-1798.

[3] Tang WH, Hartiala J, Fan Y, et al. Clinical and genetic association of serum paraoxonase and arylesterase activities with cardiovascular risk[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2012,32(11): 2803-2812.

[4] Ansell BJ, Navab M, Hama S, et al. Inflammatory/antiinflammatory properties of high-density lipoprotein distinguish patients from control subjects better than highdensity lipoprotein cholesterol levels and are favorably affected by simvastatin treatment[J]. Circulation, 2003, 108(22): 2751-2756.

[5] Sun X, Tong H, Zhang M, et al. The comparative study of Rosuvastatin and Simvastatin on carotid intima-media thickness in patients with coronary heart disease[J]. Chin J Pract Intern Med, 2012, 32(6): 452-545. [孙晓, 佟浩, 张曼, 等. 瑞舒伐他汀和辛伐他汀对急性冠脉综合征颈动脉内中膜厚度影响对比研究[J]. 中国实用内科杂志, 2012, 32(6): 452-545.]

[6] Li JY, Zhao YL, Dong J. Effect of simvastatin on expression of visfatin and leptin mRNA in ventral adipose tissue of rats with atherosclerosis[J]. J Zhengzhou Univ (Med Sci), 2012, 47(4):518-521. [李京晔, 赵玉兰, 董静. 辛伐他汀对动脉粥样硬化大鼠内脏脂肪组织中内脂素及瘦素mRNA表达的影响[J].郑州大学学报(医学版), 2012, 47(4): 518-521.]

[7] Xiao XB, Qin S, Zhang DY, et al. Effects of simvastatin on ventricular remodeling after myocardial infarction induced by TGF-β1/TAK1 pathway in rat[J]. Med J Chin PLA, 2009,34(9): 1085-1088. [肖祥彬, 覃数, 张冬颖, 等. 辛伐他汀对大鼠心肌梗死后心室重构的影响及其与TGF-β1/TAK1信号转导的相关性[J]. 解放军医学杂志, 2009, 34(9): 1085-1088.]

[8] Liao JK. Effects of statins on 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme a reductase inhibition beyond low-density lipoprotein cholesterol[J]. Am J Cardiol, 2005, 96(5A): 24F-33F.

[9] Kuzuya M, Nakamura K, Sasaki T, et al. Effect of MMP-2 deficiency on atherosclerotic lesion formation in apoE-deficient activity and concentration with angiographic severity and extent of coronary artery disease[J]. J Am Coll Cardiol, 2006, 47(12):2429-2435.

[14] Zheng L, Nukuna B, Brennan ML, et al. Apolipoprotein AI is a selective target for myeloperoxidase-catalyzed oxidation and functional impairment in subjects with cardiovascular disease[J].J Clin Invest, 2004, 114(4): 529-541.

[15] Navab M, Anantharamaiah GM, Reddy ST, et al. The oxidation hypothesis of atherogenesis: the role of oxidized phospholipids and HDL[J]. J Lipid Res, 2004, 45(6): 993-1007.

[16] Pearson TA, Mensah GA, Alexander RW, et al. Markers of inflammation and cardiovascular disease: application to clinical and public health practice: A statement for healthcare professionals from the Centers for Disease Control and Prevention and the American Heart Association[J]. Circulation,2003, 107(3): 499-511.mice[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2006, 26(5): 1120-1125.

[10] Rozenberg O, Shih DM, Aviram M. Human serum paraoxonase(PON1) decreases macrophage cholesterol biosynthesis:a possible role for its phospholipase A2 activity and lysophosphatidylcholine formation[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2003, 23(3): 461-467.

[11] Barter PJ, Brandrup-Wognsen G, Palmer MK, et al. Effect of statins on HDL-C: a complex process unrelated to changes in LDL-C: analysis of the VOYAGER Database[J]. J Lipid Res,2010, 51(6): 1546-1553.

[12] Escola-Gil JC, Rotllan N, Julve J, et al. In vivo macrophagespecific RCT and antioxidant and antiinflammatory HDL activity measurements: New tools for predicting HDL atheroprotection[J]. Atherosclerosis, 2009, 206(2): 321-327.

[13] Graner M, James RW, Kahri J, et al. Association of paraoxonase-1