镉对大鼠心室肌细胞动作及L-型钙电流的影响*

陈 悦，刘秋慧

（1．河南大学医学院生理学教研室，开封475004；2．郑州大学第一附属医院，河南 郑州450052）

镉（cadmium，Cd）是一种有毒的重金属元素，Cd对人体的影响正日益引起关注。Cd以低浓度存在于食物和香烟中，超生理范围的Cd进入机体内可引起多种组织器官的损害［1］。流行病学调查显示，环境中Cd接触与心血管疾病的发生有关［2］。亦有报道表明，0．1μmol／L的 Cd即对心肌细胞产生毒性，而同浓度对肝、肾并不产生毒性作用，说明心肌细胞对Cd更敏感，更易受到Cd的毒害。Cd对动物心脏毒性作用虽被确认［3］，但Cd对心肌细胞电生理研究的报道极少。本研究应用常规微电极和全细胞膜片钳技术观察氯化镉（CdCl2）对大鼠心室肌细胞动作电位和钙电流的影响，以探讨Cd对心室肌细胞的毒性作用及其机制。

1 材料与方法

1．1 动物和试剂

清洁级健康成年SD大鼠30只（郑州大学实验动物中心提供），体重 200～250 g，雌雄不限，随机分 5组（n＝6）。1∶250胰蛋白酶（Sigma公司分装）。CdCl2（辽宁嘉诚精细化学品有限公司），用后置于干燥、洁净螺纹口玻璃瓶中储存。溶液配制：（1）有钙台氏液 （pH 7．3，mmol／L）：NaCl 143．0，KCl 5．4，CaCl22．8，MgCl20．5，NaHC0312．0，NaH2PO40．4，Glucose 5．5；（2）储存液（mmol／L）：KOH 70，L-glutamic acid 50，KCl 40，Taurine 20，KH2PO420，MgCl2·6H2O 3，Glucose 10，HEPES 10，EGTA 1．5，pH 7．3。（3）电极液（Pipette solution，mmol／L）：KCl 20，KAspartate110，HEPES 5，MgCl2110，EGTA 10，Na2-ATP 5，用KOH调pH至7．2。所有试剂均为国产分析纯试剂。

1．2 方法

1．2．1 心室肌细胞分离及动作电位记录 将大鼠击昏后开胸，取出部分心脏置于4℃MOPS缓冲液中，去除周围结缔组织，行主动脉插管后固定于Langendorff灌流架上逆向灌流心脏，有钙台氏液 1．5 min，无钙台氏液6 min，酶溶液 13 min，储存液3 min。灌流后，将心室肌剪成小碎块，置于有储存液的烧杯中。吸取上清液，以3 000 r／min离心5 min（离心半径6 cm），弃上清液，加储存液，放4℃的冰箱保存。

另取部分心室肌于37℃95%O2和5%CO2饱和的台氏液中，用0号不锈钢针固定于恒温（36±0．5）℃，恒流（5 ml／min）灌流槽底部，以直径0．5 mm双极不锈钢电极作细胞外刺激。用微操纵仪将电极插入心室肌细胞，显示-70～-90 MV的静息电位后，插入到细胞内引出动作电位，用MCP 2000程序显示、处理分析。

1．2．2 膜片钳全细胞钙电流记录 在室温25℃下，吸取备用的细胞悬液（制备见方法1．2．1）1滴置入细胞浴槽中，置于倒置显微镜（Olympus lX70，Japan）工作台上，待细胞沉降贴壁后，用不同的灌流液持续灌流，流速2 ml／s。选择横纹清晰、边缘整齐、无收缩的细胞，通过微操纵器（Narishige，Japan）使阻抗为2～4 GΩ、内充满电极内液的玻璃微电极与细胞表面形成巨阻抗封接。在正常台氏液中加入20μmol／L 293 B和1μmol／L dofetilide以去除钾电流的影响。给予指令电位从-30～＋60 mV，波宽为300 ms，频率为1 kHz的刺激，从-30 mV开始激活的内向电流即为L型钙能道电流（ICa-L）。电流信号通过0．1 GΩ探头经膜片钳放大器的电流-电压转换输入到模转换卡变成数字A／D化频率为10 kHz，低通滤波器滤波频率为3 kHz。

1．3 数据处理

实验数据均以实验测值的均数±标准差（¯x±s）表示。动作电位的各项参数采用单因素方差分析及各组与对照组的Dunnett检验。

2 结果

2．1 不同浓度的CdCl2对大鼠心室肌细胞动作电位的影响

在台氏液中记录到动作电位后，稳定0．5 h，以累积给药法加入 CdCl2，使其终浓度分别 0．005，0．01，0．015 mmol／L，各灌流30 min。结果显示，不同浓度的CdCl2对RP无影响，对跨膜电位表现为抑制效应，使动作电位的各项参数一致减小。方差分析其抑制效应有明显的剂量依赖性，（P＜0．05，P＜0．01）。

Tab．1 Effects of the different concentration CdCl2 on APin rat myocardium（±s，n＝6）

Tab．1 Effects of the different concentration CdCl2 on APin rat myocardium（±s，n＝6）

RP：Resting potential；APA：Amplitude of action potential；Vmax：Maximum rate of depolarization；APD50：Action potential duration of repolarization 50%；APD90：Action potential duration of repolarization 90%*P＜0．05，**P＜0．01 vs control

Group RP／mV APA／mV Vmax／V／s APD50／ms APD90／ms Control -79．0±2．2 74．9±4．8 15．3±2．3 88．7±7．2 138．4±11．2 CdCl2（mmol／L）0．005 -78．1±2．5 66．5±6．7** 16．1±2．5 86．1±2．5 133．1±2．5 0．010 -81．3±4．2 50．3±2．4** 9．3±0．9* 76．3±4．2** 130．3±4．2*0．015 -80．7±3．6 46．2±3．1** 3．7±0．6** 63．7±3．6** 103．7±3．6**

2．2 不同浓度的CdCl2对大鼠心室肌细胞L-型钙电流的作用

本实验记录24个心室肌细胞内向ICa-L，每组为6个细胞。实验中使用无Na＋、K＋离子的细胞外液，应用电极内液的高Cs＋离子抑制K＋电流。各组的记录均从保持电位的 -30 mV阶跃至 ＋60 mV，持续时间为300 ms，频率为1 kHz。把配制成 0．005、0．010、0．015 mmol／L的 CdCl2分别加入到灌流液中，灌流30 min，观察给药前后ICa-L的变化。结果显示，不同浓度的CdCl2对ICa-L均具有抑制作用（P＜0．05，P＜0．01，图 1、表 2）。

Tab．2 Effects of the different concentration CdCl2 on ICa-L in rat myocardium（x±s，n＝6）

Tab．2 Effects of the different concentration CdCl2 on ICa-L in rat myocardium（x±s，n＝6）

*P＜0．05，**P＜0．01 vs control

Group ICa-L（pA／pF）Control 9．06±0．40 CdCl2／mmol／L 0．005 7．53±0．94*0．010 6．63±0．78**0．015 5．68±0．89**

Fig．1 Effects of CdCl2 on ICa-L in rat myocardium CdCl2

3 讨论

ICa-L是心肌细胞动作电位时程的重要离子电流之一，是参与形成平台期的主要离子流［4］，若ICa-L内向电流受到抑制，可使动作电位平台期缩短，从而使动作电位时程也相应缩短［5］。本实验观察到不同浓度的CdCl2对心肌细胞静息电位均无影响，但均可降低动作电位的幅度，均能缩短动作电位复极化的时程，此结果与Zhang J M，Kopanitsa M V的研究结果一致［4，5］，提示 Cd缩短动作电位时程，可能与钙内流有关。

Cd减少ICa-L，与钙通道阻滞剂维拉帕米作用一致，提示Cd是通过影响钙通道而发挥此作用的，此现象可能是镉对心肌毒性的重要机制之一，其详细机制尚待进一步研究证实。

［1］ Wennberg M，Lundh T，Bergdahl I A，et al．Time trends in burdens of cadmium，lead，and mercury in the population of northern Sweden［J］．Environ Res，2006，100（3）：330-338．

［2］ Peters JL，Perlstein T S，Perrym J，et al．Cadmium exposure in association with history of stroke and heart failure［J］．Environ Res，2010，110（2）：199-206．

［3］ 贺超才，雷毅雄，芦 茜，等．亚慢性镉染毒致大鼠心脏损伤探讨［J］．中国职业医学，2011，38（2）：95-98．

［4］ Zhang J M，Wu M N，Qi J S，et al．Amyloid beta-protein fragment 31-35 suppresses long-termpotentiation in hippocampal CA1region of rats in vivo［J］．Synapse，2006，60（4）：307-313．

［5］ Kopanitsa M V，Afinowi N O，Grant SG．Recording longterm potentiation of synaptic transmission by three-dimension almulti-electrode arrays［J］．BMCNeurosci，2006，7：61．