P-选择素对血管紧张素Ⅱ诱导的高血压致血管重构的影响1）

孙 旭，边云飞，刘改珍，孙亚丽，肖传实

血管重构（vascular remodeling，VR）是一个动态过程，包括细胞的增殖、迁移、凋亡以及胞外基质的合成、降解、重排；是血管对刺激复杂的动态反应过程，包括信号的感受、传导和调节因子的合成释放，最终使血管产生结构的变化［1］。P-选择素（P-selectin）是由血小板和内皮细胞表达的选择素家族成员之一，主要介导白细胞在血管内皮上的滚动和黏附［2］，发挥致炎作用。炎症在高血压血管重构中起重要作用，包括血管壁通透性的改变，白细胞的渗出等［3］。因此，本研究以P-selectin基因敲除鼠为基础，探讨P-selectin在血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）灌注致血管重构中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂 C57BL／6品系P-选择素基因敲除小鼠（P-selectin-／-）由首都医科大学附属北京安贞医院心肺血管疾病研究所惠赠，微量泵采用Alzet model 1007D，AngⅡ购自美国Sigma公司，小鼠血压测定使用Visitech BP2000 Blood Pressure Analysis System（美国）。兔抗转化生长因子-β1（TGF-β1）、Smad2／3多克隆抗体购自武汉博士德生物技术有限公司，二步法免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，TGF-β1、Smad3引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组 分别选取体重适合的18 g～20 g野生C57BL／6小鼠（Wild Type，WT）和C57BL／6遗传背景相同的P-选择素基因敲除小鼠，随机分为WT＋PBS（阴性对照组）、P-selectin-／-＋PBS（空 白 对 照 组）、WT＋AngⅡ［1 5 0 0 ng／（min·kg），7 d，阳 性 对照 组］、P-selectin-／-＋AngⅡ［1 500 ng／（min·kg），7 d，实验组］，每组各6只。

1.2.2 动物模型制备 采用血管紧张素Ⅱ微量泵灌注（7 d）构建小鼠高血压模型，术后第4天～7天测血压，以确定血管紧张素Ⅱ灌注成功［4］。术后第7天，1%戊巴比妥麻醉小鼠，用肝素生理盐水灌注动物，取胸主动脉，4%多聚甲醛固定。

1.2.3 免疫组织化学染色 观察蛋白在血管中的表达，并做定量分析用TGF-β1、Smad2／3一抗和HRP标记的相应二抗，结合DAB显色观察蛋白在组织中的表达。6张切片每张采图3张，BI-2000医学图像分析系统测定其灰度值，并取平均值，定量分析各组间差异。

1.2.4 RT-PCR检测 TGF-β1、Smad3 m RNA的表达 水 平用RNAiso Plus提取胸主动脉总RNA，微量分光光度计测定RNA量，调整RNA浓度使吸光度值（A260／280）在1.8～2.0。目的基因引物序列β-actin：上游5′-GTCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3′，下 游5′-AGAGGTCTTT ACGG ATGTCA ACGT-3′，184bp。TGF-β1：上 游 5′-CGCAACAACGCCATCTAT-3′，下 游 5′-CCAAGGTAACG CCAGGAAT-3′，203bp。Smad3：上游5′-ACTA CAGCCATTCC ATTCC-3′，下游 5′-TCTCCAT CTTCACTCAGGTA-3′，106bp。将 RNA反转录成cDNA，行PCR扩增，条件：94℃预变性1 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30个循环。凝胶成像仪保存图像，用Quantity one分析测定灰度值，目的基因PCR产物相对表达含量为目的基因条带灰度值／β-actin条带灰度值。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析One-Way ANOVA，方差齐使用LSD法，方差不齐使用Tamhane’s T2法，P＜0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠尾动脉收缩压（SBP）变化 微量泵灌注后7 d测量各组小鼠尾动脉SBP，每只小鼠测量10次～20次取平均值。详见图1。

图1 AngⅡ灌注7 d后各组小鼠收缩压的变化

2.2 免疫组织化学染色 各组小鼠胸主动脉中膜TGF-β1、Smad2／3的表达 TGF-β1、Smad2／3均定位于中膜层平滑肌细胞胞浆，在血管的内皮细胞层亦有表达，阳性信号为棕黄色，结果以平均灰度值（MOD）表示，MOD值越低，蛋白含量越高。详见表1。

表1 各组小鼠胸主动脉中膜TGF-β1、Smad2／3的表达±s）

表1 各组小鼠胸主动脉中膜TGF-β1、Smad2／3的表达±s）

组别 n TGF-β1 Smad2／3 WT＋PBS组 6 166.19±4.861） 126.77±4.331）KO＋PBS组 6 170.76±1.192） 132.45±4.372）WT＋AngⅡ组 6 102.88±5.17 101.72±7.60 KO＋AngⅡ组 6 167.98±3.651） 127.47±6.031）与WT＋AngⅡ组比较，1）P＜0.001；与 WT＋PBS组比较，2）P＜0.05

2.3 RT-PCR检测（见图2～图4）

图2 RT-PCR检测血管TGF-β1、Smad3 mRNA表达电泳图

图3 RT-PCR检测血管TGF-β1 mRNA表达

图4 RT-PCR检测血管Smad3 mRNA表达

3 讨 论

炎症是血管重构和纤维化的早期事件。在血小板表面表达有P-选择素糖蛋白配体-1（PSGL-1），P-选择素可通过与PSGL-1的结合，介导炎症细胞与血小板、内皮细胞之间的相互作用［5］，主要是白细胞在血管内皮上的滚动和黏附过程［6］。

在高血压进程中，血管紧张素Ⅱ的激活所介导的炎症反应，对血管重构有非常重要的作用。AngⅡ通过其ATⅠ受体来激活细胞外信号调节激酶1／2和p38丝裂原活化蛋白激酶，进一步促进平滑肌细胞增殖和Ⅰ型胶原的合成［1］，亦可直接参与诱导巨噬细胞、中性粒细胞等多种炎症细胞的浸润，诱导多种细胞因子（TGF-β）的释放，刺激成纤维细胞分化，合成大量胶原等导致胞外基质的沉积［7］。

研究表明，TGF-β1／Smads信号转导通路与心血管疾病密切相关，在高血压病、动脉粥样硬化（AS）等疾病的发病过程中起重要作用［8］。TGF-β1是已知的最重要的致纤维化细胞因子之一［9］，而Smads是TGF-β1下游的一组重要的信号转导蛋白。TGF-β1与其受体结合激活Smad2、3进入核内，发挥正反馈作用［10］。TGF-β的作用有多重性，有学者研究发现 TGF-β是细胞间质蛋白合成的强刺激因子，TGF-β1／Smads信号通路活化能促进高血压主动脉的重构，且与ERK1／2、PARP、ET-1的上调等多种信号通路有关［11］，并能促进血管新生［12］。但也有研究称TGF-β1／Smad3通道活化能抑制内皮细胞炎症蛋白表达［13］，抑制TGF-β表达可提高表面黏附分子的表达，增强白细胞的黏附作用［14］，对心血管系统起保护作用。

本实验结果显示，胸主动脉中膜TGF-β1、Smad2／3的表达，WT（PBS）较P-selectin-／-（PBS）组升高明显，WT（AngⅡ）较Pselectin（Ang Ⅱ）组 升 高 更 加 明 显，而 P-selectin-／-（PBS）与P-selectin-／-（AngⅡ）组比较差异无统计学意义，RT-PCR示TGF-β1、Smad3 mRNA与蛋白的表达趋势基本一致。综上推断：P-选择素和能够上调 TGF-β1、Smad3蛋白和mRNA的表达，主要通过加强TGF-β1／Smads信号通路的正反馈路径促进血管的重构，血管紧张素Ⅱ与P-选择素在TGF-β1／Smads通路的正反馈路径上有协同作用。

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