17β-雌二醇对大鼠子宫平滑肌自发和激发收缩活动的抑制作用*

马 勤，李红芳，△，金 姗，豆兴成，张英福，张立雪，都中蕊

（1.兰州大学基础医学院生理学教研室，2.甘肃省新药临床前研究重点实验室，3.兰州大学基础医学院机能实验室，甘肃兰州730000）

雌性动物进入初情期后，子宫会在孕激素和雌激素作用下，发生有规律的周期性变化。随动情周期不断进行，子宫肌层出现不同频率、强度、形式的收缩运动。从卵泡早期至黄体早期子宫内膜运动逐渐活跃［1］，排卵后子宫运动逐渐减弱，至分泌中晚期甚至消失［2］。这种自律性收缩运动的变化规律倍受科研工作者关注。通过对子宫肌层收缩模式的探究，获得其收缩规律，有助于判断胚胎容受性，提高妊娠率，了解不孕症病因等。

另有文献报道，17β-雌二醇（17β-estradiol，EST）可显著抑制小肠平滑肌收缩运动，且与雌二醇剂量成正比［3］；17β-雌二醇还可抑制胆囊平滑肌的收缩［4］；抑制血管平滑肌细胞的增殖与运动［5］等。然而，17β-雌二醇作用于子宫平滑肌的研究并不多见。因此，在本实验中，主要实验目的是为了研究和探讨17β-雌二醇作用于处在不同月经周期子宫内膜变化状态下子宫平滑肌的影响，用以阐释17β-雌二醇对不同时期子宫平滑肌收缩变化的作用及其潜在机制。

1 材料与方法

1.1 材料

前列腺素 F2α（prostaglandin F2α，PGF2α）和 17β-雌二醇购自 Sigma公司，溶解于二甲亚砜（dimethyl sulphoxide，DMSO，上海金山化工厂出品）。每个样品浴槽中DMSO终浓度不超过0.1%，且对子宫平滑肌基本收缩效应无干扰。

1.2 方法

1.2.1 肌条准备 实验选用35只健康SD大鼠（兰州大学实验动物中心提供），体重200～250 g，雌性。实验动物禁食一夜（12 h），饮水不限。实验当天将大鼠击昏，迅速剖开腹腔，剪取子宫约1.5 cm，立即置于含 Krebs液（单位：mmol／L，成分：NaCl 120.6，KCl 5.9，NaH2PO41.2，MgCl21.2，NaHCO315.4，CaCl22.5，及葡萄糖 11.5，缓冲 pH 7.4）培养皿中，使用钝性分离法剥离粘膜，将其切割并制成肌条（5 mm×10 mm），然后用棉线将子宫肌条固定于L形通气沟上，另一端与张力换能器相连于串联灌流实验装置上，肌肉标本分别悬挂于含（37±0.5）℃ Krebs液的恒温灌流肌槽中，保持1.5 g静息张力。在容积为5 ml的灌流肌槽中通入混合气体：95%O2和5%CO2，每20 min更换溶液，稳定30 min后累积加入 17β-雌二醇，使肌槽内药物终浓度分别为：0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0μmol／L，加药间隔5 min。张力换能器可将子宫平滑肌的收缩运动转换为电子信号，并通过BL-420E＋生物功能实验系统（TME，中国）进行记录。计算给药前1 min大鼠子宫平滑肌的张力（g）、收缩波平均振幅（g）和频率（b／min）的降低百分比（%）作为对照值，每次给药后数值作为效应值，给药前张力以静息张力值计算。同步取子宫进行通过HE染色进行形态学分析。

1.2.2 实验分组 实验分为四组（将同一只大鼠子宫肌条分配到不同加药组）：（1）EST组；（2）KCl＋EST组；（3）EST对 CaCl2诱发子宫平滑肌收缩组；（4）PGF2α＋EST组。

1.3 统计学分析

采用SPSS17.0统计软件进行数据处理，数据以平均数 ±标准误（¯x±s¯x）表示，组间各参数变化用单因素方差分析，并采用 t显著性检验。用线性回归法计算半抑制浓度（IC50），半效应浓度（EC50）及相应pD2值。

2 结果

2.1 子宫平滑肌收缩的三种基本波形与子宫周期变化的关系

大鼠子宫平滑肌的收缩运动并不规律，随月经周期的变化，出现三种不同收缩形式：一部分子宫平滑肌条表现出典型的位相性收缩（图1A），即：收缩波波形紧密、均匀，振幅稳定、持续；另一部分平滑肌条收缩曲线表现为明显的紧张性运动（图1B），即：没有位相收缩波出现，肌肉收缩仅表现为张力变化；还有一部分子宫平滑肌条收缩活动不规律（图1C），即：子宫平滑肌条收缩波不紧密，时有时无，随着时间的推移，收缩波振幅减小、频率降低，逐渐消失。

Fig.1 Sample traces showed the phasic contraction（A），the tonic contraction（B）and the untypical contraction（C）of uterine smooth muscle in rats

2.2 17β-雌二醇对大鼠子宫平滑肌自发性节律收缩活动的影响

在表现为自发节律位相性收缩的肌条中，17β-雌二醇（图2）可浓度依赖性地降低大鼠子宫平滑肌静息张力和节律性收缩频率，并减小其收缩波的振幅（表 1）。

Fig.2 Sample traces treated with ESTof uterine smooth muscle in rats（n＝9）

Tab.1 Effects of EST on spontaneous rhythmic contractions of uterine smooth muscle in rats（n＝9）

2.3 17β-雌二醇对KCl激发大鼠子宫平滑肌收缩活动的影响

在表现为紧张性收缩的肌条中，大鼠子宫平滑肌条经KCl溶液激发平衡后，依次累积加入梯度浓度的EST（图3）溶液，可浓度依赖性地降低紧张性收缩张力（表2）。用线性回归法计算子宫平滑肌条单独加入 EST后的 IC50为 7.278μmol／L，pD2＝-0.862。

Fig.3 Sample traces treated with KCl and EST of uterine smooth muscle in rats（n＝9）

Tab.2 Effects of ESTon contractions stimulated by KCl of uterine smooth muscle in rats（n＝9）

2.4 17β-雌二醇对子宫平滑肌在无 Ca2＋Krebs液中CaCl2量效曲线的影响

累积浓度的CaCl2溶液可使子宫平滑肌条出现明显剂量依赖性收缩。用50.0μmol／L的EST温育子宫平滑肌条后，CaCl2量效收缩曲线明显右移，最大收缩振幅与对照相比显著降低（图4）。用线性回归法计算子宫平滑肌条加入 CaCl2的EC50为1.422×10-3mol／L，pD2＝2.847（对照组）；EC50为 3.028×10-3mol／L，pD2＝2.519（EST组）。

Fig.4 Inhibitory actions of EST on Ca2＋-dependent contractile responses（A，B）and effects of EST on the Ca2＋-dependent contractile responses of uterine smooth muscle in the Ca2＋free Krebs solution（C）（n＝9）

2.5 17β-雌二醇对 PGF2α激发大鼠子宫平滑肌收缩活动的影响

PGF2α可激发处于紧张性收缩及非典型肌肉收缩状态的子宫平滑肌，使之产生节律位相性收缩波；PGF2α也可改变处于位相性子宫平滑肌收缩波的张力、振幅、频率。大鼠子宫平滑肌条经浓度为10-6mol／L的 PGF2α溶液激发平衡后，依次累积加入梯度浓度EST（图5）溶液，可浓度依赖性地降低激发收缩波的张力、振幅、频率（表3）。

Fig.5 Sample traces treated with PGF2α and EST of uterine smooth muscle in rats（n＝5）

3 讨论

雌激素的生物学作用可通过基因组机制（ge-nomic mechanism）和非基因组机制（nongenomic mechanism）来实现的。有学者［6］认为，雌激素与雌激素受体（ER）结合后，上述两种机制可相互协同发挥作用，共同作用于子宫平滑肌细胞。在心血管平滑肌、气道平滑肌以及脑神经等组织细胞中，雌激素可通过非基因转录机制影响 Ca2＋激活K＋通道、L型电压Ca2＋通道、细胞外信号调节酶（extracellular signal regulated kinase，Erk）通路［6］和肌醇三磷酸的生成等环节来改变细胞内游离Ca2＋浓度，调节平滑肌的收缩以及神经内分泌等生理功能。在本实验中，EST抑制子宫平滑肌自发性节律收缩，使其基础张力呈下降趋势、降低子宫平滑肌收缩振幅，减小其收缩波频率。该抑制作用具有剂量依赖关系，且肌条在中、高浓度EST作用下，收缩抑制现象可在1 min内出现，提示该抑制作用并不是作用于胞内受体，而是由非基因组机制引起。另有研究显示：在机体其他的部位存在雌激素的Gs蛋白偶联受体，雌激素作用于膜上的G蛋白偶联受体，使胞内cAMP升高，激活cAMP依赖性的蛋白激酶，引起相应蛋白质磷酸化，引起细胞的功能活动发生变化，如神经细胞膜、心肌细胞膜等。而本实验中17β-雌二醇作用于子宫平滑肌的即时效应可能也与胞浆内cAMP浓度升高，胞膜对Ca2＋的通透性降低有关，但需要进一步的证实。

Tab.3 Effects of EST on contractions stimulated by PGF2αof uterine smooth muscle in rats（n＝5）

Ca2＋是引起平滑肌收缩的关键物质，胞外Ca2＋内流主要通过肌细胞膜上的电压依赖性钙通道（PDC）和受体操控式钙通道（ROC），外 Ca2＋内流可改变平滑肌细胞内Ca2＋浓度，引起肌细胞收缩。胞外高K＋可使平滑肌细胞去极化，L-型PDC开放，胞外Ca2＋内流，从而导致平滑肌收缩。本实验中，17β-雌二醇抑制KCl激发子宫平滑肌条紧张性收缩运动，还可抑制子宫平滑肌在无Ca2＋Krebs液中CaCl2量效曲线，使曲线发生右移，此作用主要与胞膜对Ca2＋的通透性降低有关。以上实验结果显示：17β-雌二醇可抑制子宫平滑肌自发和激发收缩活动，其作用可能主要通过抑制电压依赖性钙通道介导的胞外Ca2＋内流实现。

PGF2α在体内参与许多生理过程，如眼压的调节、肾脏滤过功能和血管收缩等；PGF2α还与糖尿病、骨质疏松及月经紊乱等病症相关，但PGF2α与女性生殖系统的关系问题备受关注。在子宫内膜上，缩宫素（oxytocin，OT）启动了 PGF2α的大量释放过程［7］，过量的PGF2α引起子宫痉挛性收缩而导致痛经，且痛经的程度与PGF2α水平呈正相关。有文献表明，子宫内膜异位症（Endometriosis，EMs）患者的前列腺素（PGs）含量显著高于正常妇女［8］。另外，随着分子生物学研究的进展，发现性激素和性激素受体可能在内异症的发生、发展中起着重要作用［9］。本实验中，17β-雌二醇抑制 PGF2α激发子宫平滑肌条收缩运动的张力、振幅及频率。因此，17β-雌二醇有可能缓解由PGF2α分泌过量引起的痛经现象，以及抑制子宫内膜异位症病灶的生长。

17β-雌二醇具有较强临床应用潜能，其应用具有医学实践意义。绝经综合征和绝经相关疾病的发生与绝经后妇女卵巢功能衰退、雌激素分泌水平降低有着密不可分的关系，雌激素替代治疗即是防治这类疾病的主要措施之一。更受关注的是雌性动物进入初情期后，随着下丘脑——垂体——卵巢轴激素调节出现发情周期，每一发情周期过程中，在垂体分泌的促性腺激素、卵巢中卵泡分泌的孕激素和雌激素作用下，子宫发生有规律的周期性变化［10］。从卵泡早期开始，子宫内膜运动发生率增加，直至黄体早期。在此过程中，雌激素可调节子宫平滑肌及输卵管的收缩运动，调节胚子及胚胎的运行，子宫内膜增生期雌激素水平与子宫内膜蠕动频率呈正相关；卵泡晚期及黄体早期子宫内膜运动由活跃变安静，有助于精子定向运动及胚胎着床［1］。排卵后由于体内孕激素水平增高，子宫内膜运动功能逐渐减弱，至分泌中晚期甚至消失［2］，这是因为孕激素抑制磷酸酶C活性，阻断部分前列腺素合成，从而抑制子宫及输卵管的收缩［1］，这也有助于胚胎在宫腔内顺利着床。本实验中，处于发情周期不同阶段的大鼠，其子宫平滑肌收缩运动也不规律，随月经周期的变化，出现三种不同收缩形式：位相性收缩、紧张性收缩、以及不规则收缩。位相性运动波形出现的子宫平滑肌血管分布不丰富，HE染色判断子宫周期处于增殖晚期和分泌早期。该期切片观察：腺泡变大，部分腺泡出现内陷趋势，腺泡上皮细胞长杆状，细胞核开始变成圆形，间质细胞排列致密。紧张性运动波形出现的子宫平滑肌血管分布较为丰富，HE染色观察子宫周期处于分泌期后期。该期腺体大而延伸，呈现椭圆形或哑铃形，腺泡上皮细胞核旁有空泡形成，部分细胞有顶浆分泌，间质细胞呈圆形，有较多螺旋血管排布。而不规则波形出现的子宫肌条，HE染色观察子宫周期处于月经期和增殖期早期。该期切片观察：功能层腺体裂开，有崩塌现象，间质细胞聚集，有少量嗜中性粒细胞出现；部分切片观察腺泡形状小而圆，腺泡上皮细胞核呈长杆状，间质细胞排列很致密。这一“周期阶段——子宫收缩模式”对应规律的研究，对了解哺乳动物受精、着床等机制，以及促进人类胚胎工程技术的发展有着重要的科研及实践意义。

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