RNAi沉默STAT3基因联合mTOR抑制剂rapamycin诱导BEL－7402肝癌细胞凋亡

张 毅，张君薇，谢淑丽，王广义

（1.辽宁医学院附属第一医院微创肝胆外科，辽宁 锦州 121000；2.辽宁医学院附属第三医院肿瘤科，辽宁 锦州 121000；3.吉林大学第一医院普通外科实验室，吉林 长春 130021；4.吉林大学第一医院肝胆胰外科，吉林 长春 130021）

肝细胞癌（hepatocelluar carcinoma，HCC）是一类严重威胁人类生命健康的疾病，尽管目前针对肝细胞癌的治疗方法不断发展，如肝脏部分切除、介入治疗和肝移植等，但预后仍然较差［1］。信号转导途径中的信号分子质和量的改变都能导致信号转导的异常，细胞就会不适当的增殖，抑制凋亡，形成肿瘤［2］。研究［3］表明：多种信号转导通路的异常参与了HCC的发生与发展［3］。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是PI3K／AKT／mTOR途径的一个重要信号转导分子，通过调节下游靶分子，主要调控基因转录、蛋白质合成、细胞凋亡、细胞生长和增殖等多种生物学事件［4］。40%～50%肝癌患者PI3K／AKT／mTOR途径被激活，67%肝细胞癌患者mTOR过表达［5］。信号转导和转录活化因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）通过JAK／STAT3信号转导途径诱导与肿瘤细胞的基因异常表达有密切关联，从而促进肿瘤细胞增殖、恶性转化及阻碍凋亡。研究［6］表明：很多肝癌细胞株都有STAT3的组成型激活和表达异常。PI3K／AKT／mTOR途径中的mTOR可以磷酸化STAT3Ser727位点，活化STAT3，促进JAK／STAT3信号转导途径对靶基因的转录［7］，mTOR磷酸化STAT3将这2条信号转导途径有机的联系起来。本实验拟通过RNA干扰（RNA interference，RNAi）沉默BEL－7402肝癌细胞STAT3基因和mTOR抑制剂rapamycin抑制mTOR磷酸化，研究共同靶向抑制这2条信号转导途径对肝癌细胞凋亡的影响，并探讨作用机制，为肿瘤靶向基因治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 肝癌细胞株 人肝癌细胞株BEL－7402由吉林大学第一医院普通外科实验室谢淑丽博士惠赠。pGCsi.U6／neoRFP siRNA－STAT3和pGCsi.U6／neoRFP siRNA－scramble为本课题组前期构建，－80℃保存。pGCsi.U6／neoRFP siRNA－STAT3构建：根据文献［8］实验中验证效果最佳的针对STAT3基因（GenBank：NM＿0003150mRNA 2144～2162位核苷酸）设计靶向STAT3的特异性siRNA片段，19个特异的正义链和与其互补的19个反义链，正反链之间有9个碱基（TTCAAGAGA）间隔，反义链之后有6个T作为转录终止信号为U6启动子的中止信号，在模板链的两端加入BamHⅠ和HindⅢ酶切位点STAT3－siRNA序列，上游引物：5′－GCAGCAGCTGAACAACATGTTCAAGAGACATGTTGTTCAGCTGCTGCTTTTTT－3′；下游引物：5′－CCGGCGTCGTCGACTTGTTGTACAAGTTCTCTGTACAACAAGTCGACGACGAAAAAATTAA－3′，由上海生物工程技术有限公司合成。2条链退火形成双链结构，将STAT3－siRNA克隆至pGCsi.U6／neoRFP质粒载体。

1.2 主要试剂和仪器 DMEM培养液和新生小牛血清为美国Hyclone公司产品，LipofectamineTM2000转染试剂盒为Invitrogen公司（美国）产品，ECL发光试剂盒购自华特生生物技术有限公司（中国），caspase－3（＃9665）抗体购自Cell Signaling公司（美国），β－actin（C4，sc－47778）为Santa Cruz Biotechnology公司（美国）产品，羊抗兔IgG－HRP（Pierce）作为二抗。AnnexinV／PI试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒（JC－1）和Hoechst33258试剂盒为南京KeyGEN公司（中国）产品，rapamycin购自瑞士Alexis公司。流式细胞仪FCM BD FACSCalibur为美国BectonDickinson公司产品，倒置荧光显微镜Leica DMI 4000B为德国LEICA公司产品，半干式转膜仪为美国Bio－Rad Laboratories公司产品。

1.3 实验分组及转染 BEL－7402肝癌细胞在37℃、5%CO2饱和湿度条件下，培养于含10%灭活的小牛血清、10000U·mL－1青霉素和10000U·mL－1链霉素的DMEM培养液中，取对数生长期细胞用于实验。实验分为6组：BEL－7402细胞对照组、Rapa组、阴性质粒组（pGCsi.U6／neoRFP scramble－siRNA载体转染BEL－7402）、阴性质粒＋Rapa组、STAT3－siRNA质粒组（pGCsi.U6／neoRFP STAT3－siRNA载体转染BEL－7402）和STAT3－siRNA质粒＋Rapa组。转染组参照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书进行转染，转染后将细胞置于37℃、5%CO2培养箱中孵育，4h后更换新鲜培养基，孵育48h，吸除各孔内培养液，PBS缓冲液洗1次，向相应组别的孔内加入rapamycin浓度为109nmol·L－1的细胞培养液，其内乙醇体积分数为1%，给药后继续培养48h，收集6个板中各组细胞。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡（AnnexinV／PI荧光双染） 为了证实STAT3－siRNA靶向抑制STAT3基因联合mTOR抑制剂rapamycin协同作用，诱导BEL－7402肝癌细胞凋亡，应用Annexin V－FITC和PI染色法通过FCM BD FACSCalibur流式细胞仪检测细胞凋亡率。收集6孔板中各组细胞，PBS洗2次（2000r·min－1，5min），计数细胞，每样0.1mL含（1～5）×105个细胞，用500μL binding buffer悬浮细胞，加入5μL Annexin V－FITC，混匀，加入5μL Propidium Iodide（PI），混匀，室温避光反应10min，1h内上机检测细胞的凋亡情况。每份样品检测1×105个细胞，双参数结果以二维散点图显示，数据由FCM的计算机软件分析输出，每组设3复孔。用Annexin V－FITC和PI染色后，正常的活细胞不被AnnexinV－FITC和PI染色，位于左下象限；凋亡早期的细胞被Annexin V－FITC染色，不被PI染色，位于右下象限；坏死细胞和凋亡晚期的细胞同时被Annexin V－FITC和PI染色，位于右上象限。细胞凋亡率＝（凋亡早期细胞＋坏死细胞＋凋亡晚期细胞）／全部细胞数×100%。

1.5 Hoechst33258荧光染色检测细胞凋亡 收集24孔板中的各组细胞，小心吸去培养液，用PBS反复冲洗细胞3次，每次5min，4%多聚甲醛固定细胞30min，弃去甲醛，PBS反复冲洗3次，每次5min，自然晾干；滴加100μL Hoechst33258工作液，室温避光染色10min，去离子水冲净晾干，以紫外光340nm波长激发，荧光显微镜下观察并拍照。活细胞呈弥散均匀荧光，凋亡细胞的细胞核呈致密浓染或碎块状致密浓染。

1.6 荧光探针JC－1激光共聚焦检测线粒体膜电位（ΔΨm） 分别收集各组细胞，加入1mL JC－1染色工作液，充分混匀。37℃、5%CO2细胞培养箱孵育20min。在孵育期间，按照每1mL JC－1染色缓冲液（5×）加入4mL蒸馏水的比例，配制适量的JC－1染色缓冲液（1×），并放置于冰浴。37℃孵育结束后，吸除上清，用JC－1染色缓冲液（1×）洗涤2次。加入2mL细胞培养液，荧光显微镜下观察并拍照。ΔΨm变化率＝红色荧光细胞数／（红色荧光细胞＋红绿色荧光细胞）×100%。

1.7 Western blotting法测定活性caspase－3蛋白表达水平 分别收集各组细胞，冷PBS洗涤2次，加适量细胞裂解液冰上裂解（30min，12000r·min－1，4℃离心20min），收集上清液，即为细胞总蛋白，用BCA试剂盒分光光度计测定蛋白质浓度。各组蛋白质样本置于100℃、5min，上样，SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳，PVDF转膜、封闭，一抗（1∶500）4℃孵育过夜，二抗（1∶500）37℃孵育2h，ECL试剂发光、胶片曝光、显影、定影及结果分析，以β－actin为内参照，实验重复3次，扫描仪扫描，Launch VisionWorks LS软件测定印迹区带的灰度值。

1.8 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析。各组细胞凋亡率、ΔΨm变化率及活性caspase－3灰度值比率均以表示，组间比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 靶向STAT3和（或）mTOR作用下BEL－7402细胞凋亡率 不同组BEL－7402肝癌细胞凋亡情况：Rapa组（16.47%±1.04%）、阴性质粒＋Rapa组（43.03%±0.64%）、STAT3－siRNA组（45.44%±0.59%）和STAT3－siRNA＋Rapa组（60.22%±0.87%）细胞凋亡率明显高于对照组（9.22%±0.38%）和阴性质粒组（42.73%±0.88%）（P＜0.05），STAT3－siRNA＋Rapa组明显高于Rapa组、阴性质粒＋Rapa组和STAT3－siRNA组（P＜0.05），而Rapa组、阴性质粒＋Rapa组和STAT3－siRNA组间凋亡率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

图1 Annexin V－FITC／PI流式细胞术检测细胞凋亡率Fig.1 Apoptotic rates of BEL－7402cells detected with Annexin V－FITC／PI flow cytometry

2.2 靶向STAT3和（或）mTOR作用下BEL－7402细胞凋亡的形态学 应用Hoechst33258荧光染色检测凋亡细胞形态学变化：对照组和阴性质粒组细胞界限清晰，胞浆丰富，细胞核呈弥散、均匀荧光分布，未见凋亡细胞；Rapa组、阴性质粒＋Rapa组和STAT3－siRNA质粒组可见明显细胞凋亡现象；STAT3－siRNA＋Rapa组则有大量细胞出现细胞核聚集、边缘化和核碎裂等典型细胞凋亡形态（图2，见插页三）。

2.3 靶向STAT3和（或）mTOR作用下BEL－7402细胞ΔΨm 荧光探针JC－1激光共聚焦检测结果：对照组及阴性质粒组细胞红色荧光较强，绿色荧光相对较弱，ΔΨm较高（91.33%±1.78%和89.90%±1.92%，P＜0.05），而Rapa组、阴性质粒＋Rapa组、STAT3－siRNA组和STAT3－siRNA＋Rapa组细胞绿色荧光增强，红色荧光减弱，ΔΨm降低（57.25%±1.93%、55.69%±1.99%、59.06%±1.89%和27.28%±1.82%，P＜0.05），STAT3－siRNA＋Rapa组ΔΨm降低较其他各组明显（P＜0.05）。见图3（插页三）。

2.4 靶向STAT3和（或）mTOR作用下活性caspase－3蛋白表达水平 Western blotting检测结果：活性caspase－3蛋白在STAT3－siRNA质粒组（0.48±0.05）、阴性质粒＋Rapa组（0.59±0.08）、Rapa组（0.58±0.06）和STAT3－siRNA＋Rapa组（0.83±0.11）表达水平明显高于对照组（0.22±0.04）和阴性质粒组（0.26±0.06）（P＜0.05），STAT3－siRNA＋Rapa组活性caspase－3蛋白表达水平明显高于STAT3－siRNA质粒组、阴性质粒＋Rapa组和Rapa组（P＜0.05）。见图4。

图4 靶向STAT3和（或）mTOR作用下活性caspase－3蛋白表达电泳图Fig.4 Electrophoregram of expression of cleaved caspase－3 protein in BEL－7402cells after treated with targeting STAT3and／or mTOR

3 讨 论

mTOR作为一种大分子丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，是PI3K／AKT／mTOR转导途径重要的信号分子，调控细胞的生长、增殖和分化。mTOR的激活是通过PI3K和PKB／Akt的磷酸化实现的。磷酸化mTOR与raptor结合形成mTOR复合体1，继而激活核糖体S6蛋白激酶（S6K）和真核生物始动因子4E结合蛋白1（4E－BP1），编码一些核糖体蛋白与其他翻译调节蛋白和增加促进细胞生长的关键蛋白的翻译［9］。PI3K／AKT／mTOR信号转导途径通过磷酸化mTOR及其下游分子p70S6K和4E－BP1下传生存信号，抑制肿瘤细胞凋亡，是肿瘤发生和发展过程中的一个关键分子，成为肿瘤治疗的一个重要靶点［10－11］。

rapamycin是一种大环内酯类的mTOR特异性抑制剂，与FKBP12结合形成抑制复合物，结合于mTOR的FRB结构域，减弱mTOR磷酸化下游分子S6K1和4E－BP1的能力，抑制参与细胞周期中的mRNA的翻译途径，引起细胞周期阻滞于G1期［12］。近年来实验室及临床实验研究［13－14］表明：rapamycin对多种肿瘤均具有治疗作用。

JAK／STAT3信号转导途径主要介导细胞外信号转导到靶基因的转录，通过该途径，磷酸化的STAT3分子转位入核并结合于DNA核定位信号区，诱导相应基因的表达，如抗凋亡基因Bcl－x1和Mcl－1，细胞周期调控基因c－myc、cyclin D1及血管生成相关基因VEGF等，从而促进肿瘤细胞增殖、恶性转化和阻碍凋亡［15］。STAT3作为转录因子，成为肿瘤治疗的一个靶点。通过RNA干涉技术靶向阻断STAT3基因，诱导细胞凋亡，具有高效、特异、操作简便和低毒等特点。PI3K／AKT／mTOR与JAK／STAT3信号转导途径均与肝细胞癌有关联［16－17］，这2条信号转导途径通过mTOR磷酸化STAT3有机地联系起来，构成信号分子转导途径网络结构。本研究中流式细胞术和Hoechst33258荧光染色检测结果表明：联合靶向阻断STAT3和mTOR，明显促进BEL－7402肝癌细胞凋亡，凋亡率为（60.22±0.87）%。

凋亡是细胞在多种因素作用和调节下的程序性死亡，细胞凋亡早期就出现ΔΨm下降，早于核酸酶的激活及磷酯酰丝氨酸暴露于细胞表面［18］。为了进一步证实针对PI3K／AKT／mTOR与JAK／STAT3信号转导途径联合作用增强肝癌细胞凋亡主要通过线粒体依赖途径，本实验使用荧光探针JC－1激光共聚焦检测靶向STAT3和／或mTOR诱导细胞凋亡早期ΔΨm。JC－1是一种线粒体阳离子染料，当ΔΨm水平低时，主要以单体形式存在，为绿色荧光；当ΔΨm水平较高时，形成聚合物，为红色荧光。本研究结果表明：Rapa组、阴性质粒＋Rapa组、STAT3－siRNA组和STAT3－siRNA＋Rapa组细胞绿色荧光增强，红色荧光减弱，ΔΨm降低，STAT3－siRNA＋Rapa组降低细胞ΔΨm效应最强。靶向STAT3和／或mTOR明显降低BEL－7402细胞ΔΨm，导致线粒体膜去极化。

caspase－3是执行细胞凋亡的关键酶，无论通过线粒体依赖途径还是死亡受体介导途径，都需要将caspase－3原酶降解为小相对分子质量的活性片段，引起细胞凋亡［16］。本研究Western blotting检测结果显示：活性caspase－3蛋白在STAT3－siRNA＋Rapa组表达明显高与其他各组，提示联合治疗可明显降低细胞ΔΨm效应，激活caspase－3增强，使细胞线粒体不同程度损伤，促进肝癌细胞凋亡和坏死。

细胞凋亡的发生都存在线粒体释放Cyt c，继而发生caspases级联性激活，最终导致凋亡发生。本实验通过RNAi沉默BEL－7402肝癌细胞STAT3基因，从翻译水平阻抑STAT3基因表达，抑制JAK／STAT3信号转导途径，联合应用mTOR特异性抑制剂rapamycin抑制mTOR磷酸化，抑制PI3K／AKT／mTOR途径，诱导细胞凋亡，并同时通过mTOR抑制了STAT3Ser727的磷酸化，增强抑制JAK／STAT3信号转导途径，阻断Bcl－2基因转录，Bcl－2表达水平下降，Bcl－x1与Bax在线粒体膜上结合成复合物数量减少，Bax在线粒体膜上寡聚化，形成跨膜通道，导致ΔΨm下降，促进Cyt c释放，激活caspase，增加细胞凋亡。

综上所述，针对PI3K／AKT／mTOR和JAK／STAT32条信号转导途径联合靶向阻断，增加了肝癌细胞的凋亡率，表现出更强大而且稳定的促凋亡作用。本研究结果为肝癌细胞的信号转导途径联合治疗和靶向治疗的优化提供了体外实验数据。

［1］EI－Serag HB，Rudolph KL.Hepatocellular carcinom：epidemiology and molecular cacinogenesis［J］.Gastroenterology，2007，132（7）：2557－2576.

［2］Beerenwinke L，Antal T，Dingli D，et al.Genetic progression and the waiting time to cancer［J］.PLoS Comput Biol，2007，3（11）：e225.

［3］Nishida N，Goel A.Genetic and epigenetic signatures in human hepatocellular carcinoma：A systematic review［J］.Curr Genomics，2011，12（2）：130－137.

［4］Justin C，Ben HP.Targeting the PI3K／Akt／mTOR pathway for breast cancer therapy［J］.J Mammary Gland Biol，2012，17（3）：205－216.

［5］Treiber G.mTOR inhibitors for hepatocellular cancer：a forward－moving target［J］.Expert Rev Anticancer Ther，2009，9（2）：247－261.

［6］Seita J，Asakawa M，Ooehara J，et al.Interleukin－27 directly induces differentiation in hematopoietic stem cells［J］.Blood，2008，111（4）：1903－1912.

［7］Yokogami K，Wakisaka S，Avruch J，et al.Serine phosphorylation and maximal activation of STAT3during CNTF signaling is mediated by the rapamycin target mTOR［J］.Curr Biol，2000，10（1）：47－50.

［8］Gao L，Zhang L，Hu J，et al.Down－regulation of signal transducer and activator of transcription 3expression using vector－based small interfering RNAs suppresses growth of human prostate tumor invivo［J］.Clin Cancer Res，2005，11（17）：6333－6341.

［9］Rosner M，Hanneder M，Siegel N，et al.The mTOR pathway and its role in human genetic diseases［J］.Mutat Res，2008，659（3）：284－292.

［10］Mansure JJ，Nassim R，Chevalier S，et al.Inhibition of mammalian target of rapamycin as a therapeutic strategy in the management of bladder cancer［J］.Cancer Biol Ther，2009，8（24）：2339－2347.

［11］Sato T，Nakashima A，Tamanoi F.Rheb－mTOR signaling pathway involved in tumor formation［J］.Tanpakushitsu Kakusan Koso，2010，55（1）：11－17.

［12］Hudes GR.Targeting mTOR in renal cell carcinoma［J］.Cancer，2009，115（10Suppl）：2313－2320.

［13］Dai ZJ，Gao J，Ma XB，et al.Antitumor effects of rapamycin in pancreatic cancer cells by inducing apoptosis and autophagy［J］.Int J Mol Sci，2012，14（1）：273－285.

［14］Li C，Liu Y，Liu J，et al.Rapamycin inhibits human glioma cell proliferation through down－regulating mammalian target of rapamycin pathway and up－regulating microRNA－143［J］.Head Neck Oncol，2012，4（3）：66.

［15］Tang Y，Luo Y，Jiang Z，et al.Jak／Stat3signaling promotes somatic cell reprogramming by epigenetic regulation［J］.Stem Cells，2012，30（12）：2645－2656.

［16］Yam JW，Wong CM，Ng IO.Molecular and functional genetics of hepatocellular carcinoma［J］.Front Biosci（Schol Ed），2010，2：117－134.

［17］Bromberg J，Wang TC.Inflammation and cancer：IL－6and STAT3complete the link［J］.Cancer Cell，2009，15（2）：79－80.

［18］Xin JW，Thorsten S，Ying H，et al.The production of reactive oxygen species and the mitochondrial membrane potential are modulated during onion oil－induced cell cycle arrest and apoptosis［J］.J Nutr，2006，136（3）：608－613.