胸腺肽α1的研究进展

张鹏，黄启来，华子春，3

(1.澳门科技大学中医药学院，澳门中药质量研究国家重点实验室，澳门;2.江苏师范大学生命科学学院，江苏徐州 221116;3.南京大学医药生物技术国家重点实验室，江苏南京 210093)

胸腺肽(thymopeptide)是一类胸腺上皮细胞产生的对淋巴细胞的分化、成熟和免疫活性具有重要作用的多肽激素的总称，又称胸腺激素或胸腺素。1961年Miller和Archer分别在小鼠和家兔中首次发现。随后许多学者从小牛、猪的胸腺或者血清中分离得到胸腺肽[1]。利用等电聚焦凝胶电泳的方法可将胸腺肽分为 α1-10(PI＜5)、β1-5(5.0 ＜PI＜7.0)、γ(7.0 ＜PI)[2]。胸腺肽α1为胸腺肽α家族中的一员。近年来由于其具有较高的生物学活性和稳定性等而受到极大关注。

1 胸腺肽α1的理化性质

胸腺肽α1由28个氨基酸组成，其氨基酸序列为Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn，分子式 C129H215N33O55，分子 量3108.37，PI为4.2。它是一种针对T细胞的免疫增强剂[1]。分子中不含半胱氨酸，因此无二硫键。胸腺肽α1无糖基化，唯一的修饰是N-端的乙酰化，但乙酰基的存在与否对Tα1生物活性并无显著影响[3]。体外生物活性测定表明，Tα1的活性为TF5(胸腺五肽)的10 ～1 000 倍，且更耐酸、耐碱、耐热[4-5]。

Tα1空间结构与介质相关。在水中，Tα1并不以其优势构象存在。在有双十四烷基磷脂酰胆碱(DMPC)与二羟甲基丙酸(DMPA)(10∶1)的单层脂质体和十二烷基磺酸钠(SDS)存在时，部分Tα1呈现有序的空间构象，一定浓度的锌离子会起到同样的作用。核磁光谱实验结果表明，在疏水性较强的三氟乙醇(TFE)水溶液中，Tα1出现2个特征区域:在第5和第8个氨基酸残基之间出现一个β转角，而在第17和第24氨基酸残基之间呈现一个α螺旋构型。Tα1这种随介质而变化的构象可能是它与淋巴细胞膜相互作用所必需的，与Tα1调节免疫应答中淋巴细胞激活的引发有关[6]。

2 临床应用

2.1 Tα1可用于癌症患者手术或放化疗后的康复

癌症患者在接受手术或者放化疗后免疫系统会受到不同程度的损伤，免疫调节剂Tα1可以降低血液及神经毒性，有助于免疫抑制的逆转，推迟复发时间和延长存活时间。Salvati等[7]将22例晚期非小细胞肺癌患者随机分为两组，一组接受化疗(环磷酰胺)，另一组化疗后使用Tα1加低剂量IFNα。结果表明，化学免疫治疗比单纯化疗的响应率有所增加(分别为33%和10%)。单纯化疗组经过两个周期的化疗，CD4+、CD8+和NK细胞数量显著下降，而在化疗免疫治疗的患者中CD4+、CD8+和NK细胞数量在治疗前后无明显差异，且化疗免疫治疗可以降低患者血液学毒性。放疗法治疗肺癌会导致肺部的损伤，使用Tα1可以缓解射线对肺部的急慢性损伤[8]。使用Tα1还可以降低化疗对癌症患者的神经毒性[9]。Shuqun等[10]考察了Tα1对肝癌术后复发的预防作用，发现肝部经皮肝动脉化疗栓塞术TACE和Tα1联合使用虽然不能降低复发率，但是可以推迟复发时间和延长存活时间。Naylor等[11]发现Tα1可能对放疗和化疗导致的免疫抑制的逆转有重要作用。

恶性胶质瘤患者一般会在确诊后12个月内死亡，使用促炎症细胞因子如IL-2或者 IL-12可以延长患者的生命。Tα1作为一种免疫调节剂，可以用于促进IL-2分泌和T细胞增殖。Sungarian等[12]研究了Tα1对恶性胶质瘤患者的影响，同时研究了Tα1的体外抗肿瘤效果。研究结果表明，Tα1或者BCNU(卡莫司汀)处理可以使肿瘤明显减小。体外实验结果显示，Tα1对存活率和线粒体功能无直接影响，相反，它增加了促凋亡基因包括FasL、FasR和TNFα-R1的表达，提高了小鼠胶质瘤细胞9L对氧化压力及颗粒酶B和BCNU诱导死亡的敏感性。这些发现表明，Tα1可以通过对促凋亡机制的激活而有助于BCNU介导的恶性胶质瘤的治疗，使瘤细胞对氧化压力以及颗粒酶B和化疗药物更加敏感。Perruccio等[13]通过临床实验证实，恶性血液病患者接受HLA单倍体相合的干细胞移植后，使用Tα1不会引起急、慢性的宿主免疫排斥，可显著改善多核细胞和树突细胞的功能，增加T细胞的数量以及使功能性抗原特异性T细胞反应提早出现。Tα1与达卡巴嗪 (DTIC)和IFN-α联合使用治疗转移性黑色素瘤也具有较好的效果[14]。

2.2 Tα1可用于脓毒血症的治疗

脓毒血症(pyemia)是指化脓性细菌侵入血液后大量繁殖，并通过血流扩散至宿主体的其他组织或器官，产生新的化脓性病灶。目前脓毒血病的治疗方法是使用高剂量的皮质甾类和非甾醇类抗炎药，但此法对提高存活率并不明显。Chen等[15-16]随机选取114位严重脓毒血症临床患者。59位患者同时使用了Tα1和UTI(乌司他丁)进行联用治疗(A组)，55位患者仅使用安慰剂(B组)。通过两组的比较，A组患者在治疗后很快显示出器官衰竭方面的好转，并且在观察期表现出较好的器官衰竭的恢复。在治疗开始后CD4+/CD8+比例明显提高，促炎细胞因子如肿瘤坏死因子、IL-6，抗炎细胞因子包括IL-4、IL-10快速达到平衡。其28 d存活率提高17.3%，60 d存活率提高28.9%，90 d存活率提高31.4%。病死率降低的同时缩短在重症监护室的时间、使用呼吸机的时间和使用抗微生物和多巴胺治疗的时间。因此，使用Tα1和UTI联用治疗可以提高脓毒血症患者的存活率[17]。Tα1和血液纯化(CBP)联合使用也能够显著提高严重脓毒血症患者的细胞免疫力，促进器官功能的恢复。组合治疗可以使治疗更加有效[18]。使用Tα1联合青霉素以及乌司他丁也可以使脓毒血症患者的存活率升高[19]。

2.3 Tα1可用于治疗乙型肝炎

乙型肝炎是由乙肝病毒(HBV)引起的、以肝脏炎性病变为主并可引起多器官损害的一种传染病。乙型肝炎广泛流行于世界各国，主要侵犯儿童及青壮年，主要通过血液、母婴和性接触进行传播。少数乙型肝炎患者可转化为肝硬化或肝癌，多数无症状，其中1/3出现肝损害的临床表现。现在还没有什么特效药。为了研究Tα1胸腺肽在乙肝治疗方面的效果，Chien等[20]招募了98位通过临床病理学证明的乙肝患者，并将其随机分为3组:A组接受26周每周2次1.6 mg·次－1胸腺肽的皮下注射;B组的治疗方法与A组相同，只是要接受52周的治疗;C组作为对照组，18个月不进行特别的治疗。3组患者在开始的临床病理学指标上相当。治疗结束后，A组(40.6%)和B组(26.5%)的完全病毒学应答率要比C组(9.4%)高，没有发现明显的副作用。病理学评价显示治疗组在小叶坏死性感染和纤维化上有明显改善。这些结果表明，26周的Tα1的治疗对慢性乙肝患者是安全有效的。对于HBsAg、anti-HBe、HBV-DNA阳性乙肝，目前没有一种有效的治疗方法。Rasi等[21]通过临床实验证实，在抗HBe、HBV-DNA阳性的慢性乙肝患者中，单独的Tα1治疗不能增加病毒响应速度，但是有助于减少免疫介导的肝细胞坏死。Lim等[22]进行了一个双盲、随机和安慰剂作为对照的临床试验以比较5 mIU干扰素结合Tα1(1.6 mg·次－1，3次·周－1)和 5 mIU 干扰素加安慰剂的治疗效果。实验结果显示，联合治疗后HBeAg转阴的比例比单独治疗高出17.8%。毛海鹰等[23]也通过临床实验证明，联合使用Tα1和IFN效果好于单独使用IFN。此外，单独使用Tα1能够显著增加乙肝患者抗病毒蛋白的合成，刺激细胞因子的分泌[24]，而与IFNα联合使用可以刺激IL-2的合成，但是抑制IFN诱导IL-10的产生[25]。Tα1还能够降低抗 HBe阳性的慢性肝炎患者HBV的复制。此外，与IFNα相比，Tα1具有更好的耐受性。总之，Tα1是一种安全有效的治疗抗HBe阳性慢性肝炎的替代品[26]。蒋滨[27]发现，联合应用胸腺肽和抗乙肝免疫核糖核酸(IRNA)可以显著提高HBeAg及HBV-DNA阴性率，其效果明显优于单独使用其中一种药物。

2.4 Tα1 可用于治疗丙肝

丙型病毒性肝炎是由丙肝病毒(HCV)所引起的，是以肝脏损害为主的一组全身性传染病。近年来我国的丙肝发病率及死亡率急速上升，危害性日趋严重。2009年报告的发病人数是2003年的6倍多，死亡率窜升到传染性疾病第5位。我国约有丙肝患者4 000万。80%的急性丙肝患者没有明显症状，高达50%～85%的急性患者会转为慢性丙肝，20年后部分慢性患者发展成严重的肝硬化，甚至肝癌。目前丙肝无疫苗可预防，一旦感染丙肝，仅有20%患者自发清除病毒，隐匿的丙肝患者会成为危险的传染源。

目前，治疗丙肝的标准方案是聚乙二醇干扰素和病毒唑联用，一些患者如果没有成功清除病毒，再次治疗的效果仍然不令人满意。Tα1作为一种免疫调节剂可以用作丙肝的辅助治疗，尤其是一些难以治愈的病例。Tα1可以导致早期自然杀伤细胞的增加[28]。Th1相关细胞因子的过表达对丙肝感染的免疫介导的消除起着非常重要的作用。Tα1可以促进T细胞成熟，产生Th1型细胞因子，增强NK细胞介导的细胞毒作用。Tα1还可以增加肝脏的NKT细胞和CD8+细胞毒T淋巴细胞，减少丙肝病毒对肝脏细胞的感染[29]。Th2相关细胞因子的增加和持续感染相关。Tα1处理可以导致IL-2和2'，5'-寡腺苷酸合成酶的显著增加。单独用干扰素α处理后，两者也有较小的增长幅度，而两者联用则可以起到协同增效的作用。Tα1可以降低IL-4和IL-10的水平，而干扰素α可以增加这些细胞因子的分泌。两者联合使用可以使干扰素α的作用逆转。因此Tα1的使用可以使丙肝病人的Th1型反应增强，这对丙肝病毒的清除非常重要，使用Tα1可以降低Th2型反应，这与病毒血症的存留相关[30]。Sherman等[31]通过临床试验证实，干扰素和胸腺肽联合使用可提高HCV RNA清除率。

2.5 其他疾病的治疗

临床研究表明，将Tα1和地塞米松联用对于特发性血小板减少性紫癜患者是安全有效的[32];Tα1可以提高患者的免疫力，改善感染性休克患者的免疫功能[33];有效预防和治疗气管切开术病人的肺部感染[34];使用Tα1可以增加急性胰腺炎患者的细胞免疫，降低感染率[35];通过增加细胞免疫，防止慢性障碍性肺部疾病的恶化[36];狂犬病疫苗与胸腺肽联合使用可以短期(7 d)提高机体γ-干扰素、IL-2和中和抗体水平[37]。

3 市场状况

1997年美国赛生(Sciclone)公司开发的胸腺素Tα1获准上市，并在24个国家批准用于慢性乙型肝炎的治疗，在欧、美、日等国家也用于治疗丙型肝炎、肝细胞癌及免疫疾病，赛生公司的胸腺肽Tα1已在我国注册。自20世纪末，赛生公司的产品日达仙进入我国市场以来，以其抗病毒和抗癌症方面的良好疗效，销售额逐年递增。2003年北京SARS患者日达仙治疗费用在20万元左右，绝大部分由医保基金统筹支付。根据病情轻重及其治疗方案不同，治疗费用从数万元到20多万元不等。2003年二季度，赛生药业销售收入同比激增3倍，达1 500万美元。2009年美国赛生药业的胸腺肽Tα1销售额已达7 240万美元，折合人民币约4.9亿，增长34%。平均每个肝病患者4 500美元的药费是支撑起这一业绩基础。公司该产品销售收入的96%来自我国，即该产品在国内的销售额高达4.7亿元。

自2002年起，我国在胸腺肽Tα1开发方面进展快速，同年10月，SFDA批准四川源基制药有限公司生产原料药，成都地奥九泓制药厂生产1.6 mg粉针剂。随后，海南双成药业、海南中和药业分别获得了SFDA颁发的原料药及注射剂生产批件。

该产品的市场前景很广阔，在多种病毒性疾病和免疫力低下的疾病中需求巨大，尤其在每年上百万活动期乙肝患者和各种肿瘤患者中占有很大的份额，。

4 基因工程方法生产胸腺肽

Tα1是Goldstein等通过离子交换层析和过滤从TF5中首次分离得到。目前在中国市场上取得胸腺肽α1批准文号的产品只有美国赛生公司的日达仙、海南双城的基泰、海南中和的和日和成都地奥的迈普欣。这些企业均通过化学合成方法生产。化学合成胸腺肽由于产率较低，致使其成本较高，而且作为进口药品，日达仙一直享受单独定价的权利，价格大约是国内仿制药的五倍，相应增加了患者的费用，使其临床应用受到了限制。

为了满足日益增长的临床需求，降低患者的费用，需要发明一种新工艺以提高胸腺肽的生产水平。利用基因工程的方法生产胸腺肽α1具有高效、快速、低成本等优点，是一种非常有吸引力的大批量生产的方法。但目前这一方法仍处于研究阶段，市场尚无基因工程Tα1上市。

目前，胸腺肽α1在原核系统和真核系统中的表达均有研究。在原核系统中的表达宿主主要集中在大肠杆菌，而在真核系统的表达宿主主要是酵母菌，也有学者在西红柿中成功表达Tα1。

4.1 胸腺肽Tα1在原核系统中的表达

Zhang等[38]在hTα1的C端加入6个组氨酸的标签，得到克隆pET-28a-h Tα1，然后在大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达，重组蛋白占总蛋白的比例为50%～60%，并采用基于温度变性的镍亲和层析和高效液相色谱方法进行分离。纯化方法具有很高的重现性和易操作性。纯化的重组hTα1显示出高的同质性，纯度经过电泳和HPLC检测可达到99%。等点聚焦分析显示其pI值为4.0，全波长扫描分析显示其最大吸收峰在214 nm。Chen等[39]将Tα1的基因克隆到pET-28a、pET-9c、pThioHis B、pGEX-2T 和 pBV222 5种质粒中，然后在大肠杆菌表达，通过比较发现在BL21/pET-28a表达系统中的产量最高，可以达到细菌总蛋白的70%，并为可溶形式。

由于Tα1编码的多肽过短，直接表达容易被宿主菌降解，很难利用基因工程的方法实现直接表达，因此在原核系统中的表达目前主要可以采用串联体表达和融合表达等方式。

4.1.1 串联体表达 Li等[40]将2个Tα1的串联体蛋白在大肠杆菌中表达。通过HPLC分析表明，纯化后的串联体的纯度可达到95%以上，并且该串联体蛋白可以刺激小鼠脾淋巴细胞的增殖并能够增加肿瘤细胞系的凋亡。活体条件下串联体可以显著地抑制B16小鼠肿瘤的增长。与Tα1相比串联体显示出更强的生物活性。Chen等[41]根据植物密码子偏好性设计合成了4xTα1基因，并且将其插入到大肠杆菌的表达载体pQE30中，然后转入大肠杆菌M15。4xTα1蛋白在大肠杆菌中以可溶性形式表达，纯化后的蛋白通过MTT实验分析表明，4xTα1蛋白能够刺激小鼠脾淋巴细胞增殖。这是首次报道根据植物密码子偏向性设计的基因在大肠杆菌中表达，并且为在植物中表达Tα1提供了基础。

4.1.2 融合表达 Esipov等[42]使用基于 pET32b+质粒在大肠杆菌ER2566中的表达系统，以获得硫氧还蛋白和Tα1的融合蛋白，中间插入了一个TEV的酶切位点。融合蛋白以可溶性的形式过表达，通过离子交换层析纯化，通过无水乙酸进行乙酰化处理，然后利用反向HPLC纯化。每升发酵液最终可以获得29 mg的靶蛋白。此方法简单而且低成本，是一种适合于大量生产重组Tα1的方法。刘先俊等[43]将Tα1和TNFα1的融合蛋白的DNA序列克隆到pET-22b(+)载体中，在BL21(DE3)-Codonplus-RP-X中表达。表达的产物是一种可溶性的蛋白，其产量大约为总蛋白的20%，经过(NH4)2SO4沉淀和疏水柱层析，最后的纯度可以达到96%。经鉴定，融合蛋白抗病毒活性强于市售的IFNα1b和IFNα2b。与市售的胸腺肽类似可以刺激胸腺细胞的增殖。融合蛋白显示较强的抗HBV的活性[43]。

Korobko等[44]将 TNF 和 Tα1 构建为重组质粒，其重组方式分为两种，第一种将TNF连接在Tα1的左侧，第二种将TNF连接在Tα1的右侧，并在大肠杆菌中表达重组蛋白。研究发现:重组的蛋白TNF-Tα1被分泌到大肠杆菌的周质空间，而重组蛋白Tα1-TNF在细胞中则以不可溶的形式聚集。两种蛋白经不同方式进行纯化。融合蛋白TNF-Tα1具有细胞毒实验的全部生物活性。而重组蛋白Tα1-TNF则只有非常小的生物活性。重组蛋白用溴化氰处理后形成2个多肽的混合物，将此混合物经过简单的柱层析即可分离。Shen等[45]将Tα1和可溶性B淋巴细胞刺激因子融合并在大肠杆菌中过表达。蛋白的分子量为28 kDa。利用Ni柱纯化后，融合蛋白具有B淋巴细胞刺激因子的活性并且比Tα1略高。由于具有Tα1和B淋巴细胞刺激因子的双重功能，此融合蛋白可以用于各种免疫缺陷症的治疗以增强宿主的免疫反应。Fedorov等[46]将重组蛋白CNF-T基因克隆在pThy315中，并且在大肠杆菌SG200-50中以包涵体的形式表达，它与其他蛋白以二硫键形式结合形成高分子复合物。在DDS-Na和DTT中使复合物变性，然后用葡聚糖G-100凝胶层析进行分离，不含有DDS-Na的纯化产物具有很强的对鼠恶性腺瘤L-929细胞的细胞毒性。

4.1.3 与RimJ共表达 生物合成Tα1的障碍除了小肽的表达困难以外，另一方面是N端的乙酰化困难。为了有效获得N端乙酰化的Tα1，Ren等[47]构建了一个Tα1内含肽融合蛋白，其N端与一个最小的迷你内含肽融合(Sp1 DnaX)，C端加入了一个His tag。由于Tα1的N端连接了一个内含肽融合蛋白，当Tα1内含肽融合蛋白与RimJ(真核生物的N端乙酰化酶)共表达时，用β-巯基乙醇或者二硫苏糖醇以及升高温度诱导，会导致内含肽介导的N端切割。条件优化后，1 L发酵液可以获得24.5 mg的Tα1，经过一系列的纯化后，其纯度可以达到98%，相对分子质量为3 107.44，这与合成的 Tα1分子量非常接近。重组Tα1的氨基酸序列经过分析确认，结果显示其N端被乙酰化。

4.2 Tα1在真核系统中的表达

Chen等[48]使用人血清白蛋白和Tα1在酵母菌中融合表达，中间无连接肽。然后通过离子色谱等方法纯化，产物纯度可以达到97%。体外脾淋巴细胞增殖实验表明，rHSA-L-Tα1不仅具有比Tα1更高的促进脾淋巴细胞成熟的作用，而且可以抑制地塞米松导致的T淋巴细胞的凋亡。在氢化可的松引起的免疫抑制小鼠中的活体实验中，连续7 d注射融合蛋白和Tα1，体重净增长，脾指数和胸腺指数明显增高，体液中SOD水平升高而MDA水平则下降，药动学指数升高并且半衰期延长。胸腺五肽可以改善免疫失调患者的免疫系统。然而，其在血浆中的半衰期很短。为了获得更加稳定而且有活性的胸腺五肽类似物，Gao等[49]将Tα1和胸腺五肽融合并且克隆到pGAPZalphaA载体中。融合多肽在酵母中表达并且经过金属螯合层析和凝胶过滤层析纯化。圆二色光谱分析发现:融合蛋白的二级结构主要是一个α螺旋和无规卷曲。体外分析显示，融合蛋白的半衰期为(140±14)min，比胸腺五肽的半衰期[(5.6±0.7)min]以及 Tα1的半衰期[(127±11)min]长。体外活性实验表明，融合蛋白可以促进昆明鼠脾细胞的增殖，并且其促使吞噬细胞和巨噬细胞分泌IL-2的能力比单独使用Tα1和 TP5都要强[49]。Chen等[50]构建了一个Tα1酵母表达系统，首先将Tα1克隆到酵母pYES2载体，然后将pYES2-Tα1转入酵母，用乳糖代替葡萄糖以诱导Tα1的表达。通过Western blotting确认Tα1正确表达后，用此干酵母饲喂Balb/c小鼠(其免疫系统被环磷酰胺抑制)，用合成的Tα1作为正对照，空载的酵母作为负对照。合成的Tα1和含有pYEST2-Tα1的干酵母均可以增加CD8+细胞的水平。黄雯等[51]根据酵母密码子偏向性设计 hTα1基因，利用over lapping PCR技术将其与核糖体蛋白基因的5'端进行连接，然后插入pPIC载体，并通过电转化转入HIS4突变菌株GS115。SDS-PAGE和Western blotting结果表明融合蛋白表达成功，其表达水平为25 mg·L－1。Yang等[52]利用PCR和分子克隆技术，构建了IFNalpha2b-(G4S)n-Tα1(n=1-3)融合基因并将其克隆到真核表达系统pPIC9中。在酵母中表达得到融合蛋白，利用DEAE亲和层层技术，Superdex75凝胶过滤进行纯化。使用抗病毒和E-玫瑰花结实验分析发现，纯化的融合蛋白显示出抗病毒和增加E玫瑰花结的能力。Chen等[53]根据植物密码子使用偏向性设计并合成了Tα1基因，基因由4个Tα1首尾相接。将其克隆到植物偏向性表达载体PG-pRD12中，然后通过根癌脓杆菌介导转入西红柿。通过筛选获得了54株卡那霉素抗性的植株。其中4株通过RT-PCR分析显示，4xTα1基因在西红柿果实中发生了转录。ELISA分析表明，在成熟的果实中 4xTα1 蛋白的浓度可以达到 6.098 μg·g－1。Western blotting结果进一步证实，4xTα1在转基因西红柿果实中表达。MTT实验结果显示，转基因西红柿中的4xTα1蛋白具有刺激小鼠脾淋巴细胞体外增殖的能力，这是首次报道Tα1在植物中表达。

5 展 望

随着胸腺肽α1作用机制的深入研究，其临床应用必定会更加广泛，市场需求也会进一步扩大。胸腺肽的基因工程生产方法以及新的更加有效的分离纯化方法逐渐走向成熟，必将会以其高效、快速、低成本等优势替代化学合成的胸腺肽成为市场的主流。

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