内质网应激与肿瘤

金学英，汪步海

(扬州大学医学院苏北人民医院肿瘤科，江苏扬州 225001)

内质网是细胞内Ca2+存储和蛋白质合成的主要场所，多种刺激(如营养匮乏、乏氧、酸中毒等)可致细胞内Ca2+平衡紊乱或内质网中蛋白质堆积，从而导致内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)的发生。ERS主要包括以下3种反应［1］:未折叠蛋白反应(unfolded protein reactive，UPR)、内质网超负荷反应(endoplasmic reticulum overload response，EOR)和固醇调节级联反应。UPR和EOR是蛋白质在内质网中堆积所引起，而固醇调节级联反应是在内质网上合成的胆固醇损耗所致。目前研究表明，ERS中UPR和EOR可能与肿瘤发生、发展、转移及预后密切相关。

1 ERS中的信号转导通路

1.1 UPR中的信号转导通路

ERS时UPR对细胞主要起保护作用，目前已知的哺乳动物体内UPR有3条转导通路:双链RNA激活的蛋白激酶样内质网激酶(PKR like ER kinase，PERK)信号转导通路、需肌醇酶1(type-I endoplasmic reticulum transmembrane protein kinase，IRE1)信号转导通路和活化转录因子6(activating transcription factor 6，ATF6)信号转导通路［2］。当细胞处于正常状态时，PERK、IRE1和ATF6与葡萄糖调节蛋白78(glucoseregulated protein78，GRP78)结合而失活，ERS时GRP78与未/错误折叠蛋白结合，PERK、IRE1和ATF6与GRP78解离而激活引起下游元件的激活进而介导细胞生存与凋亡，但PERK、IRE1和ATF6上游激活机制目前尚不明了。

PERK信号转导通路:ERS过程中，激活的PERK使真核翻译起始因子-2的α亚基(eukaryotic translation initiation factor-2 alpha subunit，eIF2α)51 位的丝氨酸磷酸化而失活，抑制内质网中大部分蛋白质的合成，减少内质网中蛋白质的堆积，但少数与应激相关的基因如ATF4却表达上调。激活的ATF4使与凋亡有关的C/ERB同源蛋白质(C/ERB homologous protein，CHOP)/生长抑制和 DNA损伤基因(growth arrest and DNA damage gene，GADD153)的转录上调，从而诱导细胞凋亡［3］。

IRE1信号转导通路:IRE1是发现最早也最重要的调节蛋白，具有抗凋亡和促凋亡的双重作用［4］，主要表现在以下三方面:(一)活化的IRE1通过其核酸内切酶活性剪切去除X盒结合蛋白1(X-box binding protein 1，XBP-1)mRNA的26个内含子，使其成为成熟的mRNA，进而翻译出大量XBP-1蛋白。XBP-1与内质网应激反应元件(endoplasmic reticulum stress response element，ERSE)结合，诱导 GRP78 和CHOP 基因表达进而诱导内质网甘露糖苷酶样蛋白(endoplasmic reticulum mannosidase-like protein，EDEM)的表达，增加错误折叠蛋白的降解，促进内质网功能的恢复。(二)活化的IRE1激活凋亡信号调节激酶 1(apoptosis signalregulating kinase 1，ASK1)及其下游靶基因氨基末端激酶(jun N-terminal kinase，JNK)和核转录因子(nuclear factor kappaB，NF-κB)，磷酸化的JNK通过激活促凋亡因子bcl-2介导的细胞凋亡(Bcl-2 interactingmediator of cell death，BIM)并抑制抗凋亡因子B细胞淋巴瘤/白血病2(B cell leukemia-2，bcl-2)促进细胞凋亡，而 NF-κB主要表现为促进bcl-xl，肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis factor receptor associated factor，TRAF)、凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)等抗凋亡蛋白的转录抑制细胞凋亡蛋白caspase家族成员的转录激活，从而抑制细胞凋亡。(三)活化的IRE1通过激活内质网特有的Caspase-12凋亡通路促进细胞凋亡［5］。

ATF6信号转导通路:解离的ATF6向高尔基体转位，被核内切酶片段1(site-1 protease，S1P)和核内切酶片段2(site-2 protease，S2P)剪切激活后进入细胞核内，激活的ATF6可以上调与蛋白质和脂类合成相关的内质网诱导基因的表达。在哺乳动物中，UPR的启动依赖于ATF6的激活，激活的ATF6结合UPR靶基因的顺式作用元件ERSE，上调其下游基因如内质网分子伴侣GRP78的转录，促进蛋白质的折叠［6］。同时与非折叠蛋白反应元件及ERSRⅡ结合，诱导包括CHOP在内的基因表达，介导细胞凋亡。

1.2 EOR中的信号转导通路

在ERS反应过程中，大量糖蛋白沉积在内质网引起EOR、EOR和UPR相对独立但又存在共同的信号通路。Eike等［7］报道，EOR时细胞内 Ca2+平衡紊乱导致细胞内大量的活性氧片段(reactive oxygen species fragment，ROS)产生，激活炎症因子 NF-κB。有研究人员［8］的研究表明，IRE1在 EOR中处于中心地位，与GRP78解离后，磷酸化的IRE1聚集肿瘤坏死因子受体相关因子2(tumor necrosis factor receptor associated factor，TRAF2)而激活系列免疫相关激酶，以ASK1最为重要，形成IRE1/TRAF2/ASK1复合体，级联激活JNK及NF-κB，诱导细胞发生抗凋亡反应。此外，Chen等［9］的研究表明，EOR可以促进GRP78的表达上调及caspase-12的激活。

2 ERS与肿瘤的发生

有文献［10］报道超过15%肿瘤的发生与慢性炎症相关，如胃癌可继发于Hp感染［11］、宫颈癌常继发于HPV16-18 感染［12］、肝癌常继发于慢性乙型肝炎［13］等。同时有文献［14］报道，在不同类型的肿瘤细胞中都存在ERS。

炎症和ERS之间存在一定联系。近期研究［15］表明，在肿瘤细胞和骨髓基质干细胞中ERS与促炎症因子NF-κB的转录激活相关。一方面，EOR时内质网中未/错误折叠蛋白的堆积导致内质网中Ca2+从内质网中漏出，引起线粒体中Ca2+的积聚进而导致线粒体内膜去极化，中断呼吸链中电子的转移，导致ROS的产生并介导NF-κB的激活;另一方面，ERS通过PERK和IRE1α转导通路的激活介导NF-κB的激活，进而激活蛋白激酶JNK。激活的NF-κB主要表现为三方面的作用［16］:(1)NF-κB和JNK的激活是引起炎症反应的关键因素，启动包括COX-2的促炎症因子的基因转录，促进炎症反应的发生。(2)促进包括 bcl-xl、TRAF、IAP在内的抗凋亡蛋白的转录，抑制caspase家族成员的转录激活。(3)增强细胞周期蛋白cyclinD1的表达，促进细胞周期中G1/S、G2/M之间的转化，从而促进细胞生长。Deeb等［17］的研究表明，在前列腺癌中PERK通过激活的NF-κB显著上调抗凋亡bcl-2、bcl-xl、cIAPI和生存素survivin的表达而促进肿瘤的发生。Li等［18］的研究表明，在长期持续暴露于砒霜的SKH-1大鼠模型中，砒霜通过介导PERK和IRE1α的磷酸化激活NF-κB，进而诱发暴露于砒霜的皮肤发生癌前病变(黑角病和角质化)，并可能发展为基底细胞癌和鳞状细胞癌。

肿瘤的发生是遗传、环境和基因突变等多因素作用的结果，在肿瘤细胞中凋亡与抗凋亡的失衡导致肿瘤细胞的无限增殖。NF-κB的激活可以通过其抗凋亡作用介导细胞周期蛋白的表达而促进细胞的生长，可能在肿瘤形成的过程中起重要的作用。

3 ERS与肿瘤细胞的凋亡

ERS通过多种途径介导细胞凋亡反应，包括ERS引起的凋亡反应和与NF-κB介导的抗凋亡反应。ERS引起细胞凋亡主要有3种途径:CHOP/GADD153通路、JNK通路、ER特有的Caspase-12通路。从ERS到凋亡典型的通路是PERK/eIF2α下游的转录因子GADD153/CHOP的表达。当ERS持久存在时，激活的PERK通过eIF2α磷酸化使ATF4表达上调，诱导促凋亡因子CHOP/GADD153的表达促进细胞凋亡。激活的IRE1和ATF6，其胞浆部分进入核内，与ERSE保守基序列 CCAAT(N9)GCACG中的 GCACG相连，CCAAT被NF-Y占据，启动CHOP/GADD153转录与表达，通过抑制抗凋亡基因bcl-2的表达上调引起内质网氧化损伤。Fujiwara等［19］通过对荷尔蒙抗拒的前列腺癌细胞DU145和PC3细胞的研究表明，利用siRNA干扰技术下调促凋亡因子CHOP/GADD153的表达可引起细胞凋亡。此外，IRE1信号通路可通过介导JNK的激活和Caspase-12的激活促进细胞凋亡。在非ERS时IRE1/TRAF2/Precaspase-12形成复合物，ERS时Precaspase-12与TRAF2分离而引起Caspase-12的激活，Caspase-12活化后诱导GRP78、GRP94等分子伴侣产生增加并级联激活Caspase-9、Caspase-3和caspase-7等效应分子，caspase-3，7，9通过线粒体途径和死亡受体途径诱导凋亡的发生［20］。而有相关文献［21］报道caspase-12仅存在于锯齿动物中，在人类，caspase-4起caspase-12的作用。Wu等［22］在食管癌细胞EC109中首次证实，腺苷可以通过 CHOP和caspase-4通路诱导食管癌细胞凋亡。

NF-κB抗凋亡作用主要表现在:激活的NF-κB通过上调C-IAP1、C-IAP2和生成素survivin等的表达抑制caspase的凋亡通路。一方面上调的C-IAP1和CIAP2通过与Caspase-9前体结合抑制其激活进而阻止Caspase-3前体的激活，阻断Caspase级联反应引起的细胞凋亡。另一方面上调的Survivin可以作用于细胞周期依赖性蛋白激酶CDK4，形成survivin/CDK4复合物，使P21从P21/CDK4复合物中释放出来，解离的P21蛋白对细胞周期抑制作用消失并作用于Caspase-3前体，形成Procaspase-3/P21复合物，抑制Caspase-3激活引起的凋亡［23］。此外，激活的NF-κB与bcl-2上特异性的NF-κB的结合位点结合，通过转录途径直接上调bcl-2表达阻止细胞凋亡。Hoffmann等［24］的研究表明，在高表达抗凋亡因子Bcl-2的Jurkat细胞系、乳腺癌细胞MCF-7和胰腺癌细胞L63PC，NF-κB抑制剂锦鸡素可以通过抑制NF-κB的表达从而克服Bcl-2诱导的治疗抵抗。ERS通过促进促凋亡反应诱导肿瘤细胞的凋亡，通过抗凋亡反应导致细胞的无限增殖，促进肿瘤细胞在不利微环境中的生存。

4 ERS与肿瘤新生血管生成

ERS时UPR可以影响血管因子的表达促进肿瘤新生血管的形成，Wang等［25］研究表明，由葡萄糖缺乏引起的UPR可以上调促血管生成因子血管内皮生长因子(VEGF)、FGF2和IL6的表达并下调血管生成抑制因子 THBS1、CXCL14和 CXCL10的表达。其中VEGF是针对内皮细胞特异性最高，促血管生长作用最强的有丝分裂原。Ghosh等［26］的研究表明，ERS时IRE1α-XBP1、PERK-ATF4和 ATF6α分别直接作用于VEGF基因的不同区域独立调节VEGFA mRMA的表达。其中，PERK-ATF4途径中 ATF4直接结合到VEGFA基因的第1个内含子促进VEGFA的表达，而ATF6则通过与促VEGFA受体结合促进VEGFA的表达。在肝癌细胞中通过siRNA技术分别沉默IRE1α-XBP1、PERK-ATF4和 ATF6α 的表达，均可降低VEGFA的表达及肿瘤细胞血管的生成，而这一作用与乏氧诱导因子的表达无关。

据报道［27］，VEGF在多种肿瘤细胞中高表达，不仅是关键的血管形成刺激因子，同时对肿瘤的侵袭和转移起重要作用。Auf等［28］在对胶质瘤细胞的研究中发现，抑制IRE1的表达可以减少肿瘤细胞新生血管形成、降低肿瘤的生长速率并增加肿瘤细胞的侵袭性。此外，激活的NF-κB可以通过上调环氧合酶2(cyclooxygenase2，COX-2)的表达促进肿瘤新生血管的生成。Manu等［29］研究表明，γ-生育三稀酸通过抑制NF-κB引起COX-2的上调，减少胃癌细胞的新生血管形成以及对卡陪他滨的化疗抵抗。

5 ERS分子伴侣GRP78与肿瘤的关系

GRP78在多种肿瘤细胞中高表达，通过激活UPR信号转导通路影响肿瘤的生存和发展。激活的转录因子ATF6和ATF4通过上调GRP78的表达，促进内质网中蛋白质的正确折叠［30］。Fasano 等［31］研究表明，降低GPR78的表达可以显著增强二十二碳六烯酸(DHA)诱导结肠癌细胞系HT-29、HCT116和SW480的凋亡作用。Martin等［32］对黑色素瘤细胞CHL-1和WM266-4细胞的研究表明，通过RNAi干扰技术抑制GRP78的表达可以抑制芬维A酸诱导的肿瘤细胞的凋亡。另外，GPR78的高表达与肿瘤的预后不良及肿瘤的治疗抵抗相关。通过对乳腺癌患者的回顾性研究发现［33］，GRP78和 IRE1α 在乳腺癌患者中的表达分别高达70%和90%，而GPR78的高表达可以缩短肿瘤复发的时间。Huang等［34］研究证实，降低GRP78的表达可以增强塞来考昔在泌尿道上皮细胞肿瘤中的细胞毒性，降低肿瘤的抗药性。然而Adrienne等［35］研究表明，过表达的GR78可以与PERK、ATF6、IRE1结合使其失活，抑制UPR反应通路，对UPR起负反馈调节作用。

6 结 语

ERS在肿瘤的发生、发展过程中普遍存在，对细胞的生存具有双向调节作用，既可以对细胞起保护作用，又可以诱发肿瘤的发生并促进肿瘤细胞的生存、发展、新生血管生成及治疗抗拒性。通过抑制ERS信号转导通路中某种基因或蛋白的表达从而抑制肿瘤细胞的生长，成为肿瘤治疗的分子靶点。

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