昆虫标本DNA提取的研究进展

胡泽章，黄 建，王竹红

(福建农林大学植物保护学院，福建福州350002)

昆虫分子系统学是一门从分子角度解释昆虫多样性、系统发育及进化规律(进化历史)的学科(黄原等，1995)。获取有效高质的DNA是进行昆虫分子系统学研究的基础。伴随着PCR技术的产生和测序技术的不断完善，获取标本DNA一维信息的技术也得到进一步的发展(庞俊峰和张亚平，2001)，这使得从馆藏标本中提取DNA成为可能。此外，积累多年的馆藏标本，具有收藏标本量大、种类齐全、耗费人力物力成本低等优势，特别是标本中含有很多难以再获得的稀有类群，这些都将大大有利于昆虫分子系统学的研究(朴美花等，2002;杜世章和陈立侨，2004)。

中国昆虫标本DNA的研究开始于20世纪90年代，有文献可查的报道最早见于瓢虫干标本基因组DNA的提取及RAPD分析(张迎春和郑哲民，1999)。与新鲜样品相比，从长时间保存的标本中获得的DNA含量极低、片段较短，而且难以进行PCR扩增，DNA的质量明显较差(庞俊峰和张亚平，2001)，为此，很多学者对其进行了研究。从大量文献可以看出，有关研究主要包括探讨标本不同保存方式提取DNA的优劣(张迎春等，2002;张建珍等，2004;张晟铭等，2009)、改良不同保存方式标本DNA提取的方法(朴美花等，2002;徐光勇等，2003)以及比较不同的DNA提取方法的优劣(黄为等，2008;谭亮魁和王文凯，2008;乔枫等，2011;常虹等，2013)。这些研究旨在提高昆虫标本DNA提取的质量，以便更好进行分子系统学研究。

昆虫标本主要分为昆虫干制标本和昆虫浸渍标本，不同的保存方式对于标本DNA的影响也是不同的。所以本文根据已报道的相关文献，综述了不同保存方式对昆虫标本DNA质量的影响，提取DNA前的预处理以及DNA的提取方法，提高DNA提取的质量。

1 影响昆虫干制标本DNA质量的原因

昆虫干制标本根据烘干方式的不同分为烘干标本和自然阴干标本，影响干制标本DNA质量的主要原因是干标本DNA本身易降解等特性和馆藏条件(徐光勇等，2003)。DNA降解的机理是:机体死亡后，细胞内的DNA修复机制丧失。由于DNA的化学性质极不稳定，可以通过水解或氧化作用自发降解(庞俊峰和张亚平，2001)，所以对于干标本来说，标本保留多少DNA分子最关键的时期是从标本死亡到标本完全干燥的时间长短，而与标本的保存年代没有相关性(庞俊峰和张亚平，2001)。张迎春等(1999)在对瓢虫干标本基因组DNA的提取及RAPD分析和徐光勇等(2003)对天牛干标本DNA的提取及RAPD-PCR扩增反应的结果印证了这个观点。张迎春等(2002)通过对不同储存处理的4个目7种昆虫进行DNA提取结果表明:烘干标本提取的DNA质量很好，而自然阴干标本若环境湿度大则易霉变，提取的DNA易发生降解。外骨骼质地坚硬密闭的昆虫受到外骨骼影响，其标本体内水分不易蒸发，DNA降解严重。所以从自然阴干的昆虫标本提取DNA失败几率很大(张晟铭等，2009)。

2 影响昆虫浸渍标本DNA质量的原因

与昆虫干制标本相比，昆虫浸渍标本使用固定剂对标本进行保存，DNA的降解率相对较低。影响昆虫浸渍标本DNA质量的主要原因在于固定剂对DNA的生理生化作用，以及固定剂成分对DNA提取试剂的影响。昆虫浸渍标本经常使用的固定剂有乙醇和福尔马林。

乙醇作为常用的标本固定剂，具有渗透力强、防腐杀菌效果好、固定速度快、抑制DNA酶活性等优点(魏方超等，2012)。乙醇对标本DNA的影响主要是造成标本细胞内失水、加重细胞内DNA和蛋白质之间的交联现象、破坏蛋白酶K的结构、干扰细胞的消化作用(闫晗等，2012)。很多研究表明，乙醇作为固定剂保存标本可以满足DNA提取的要求。庞虹(2001)对六斑月瓢虫进行研究认为，多年保存的酒精浸泡标本可以作为分子系统学研究的材料;张迎春等(2002)通过对7种昆虫的不同标本类型进行了基因组DNA提取比较，认为乙醇浸泡标本可以作为分子系统学研究首选的标本类型;张大治等(2004)对蜻蜓目昆虫DNA的提取方法研究认为，从乙醇浸泡标本中提取DNA是一种切实可行的方法;张建珍等(2004)对不同保存方式下蝗虫组织DNA的提取及RAPD分析中也认为，100%乙醇标本是RAPD的最佳标本保存方式;张晟铭等(2009)对不同保存方式的云杉八齿小蠹总DNA提取方法的比较试验结果也认为，用乙醇保存标本效果极佳;闫华超等(2011)对蜜蜂DNA提取时认为，75%乙醇保存蜜蜂标本较适合于DNA的提取;郑斯竹等(2012)通过天牛幼虫保存方式对DNA提取效果的研究表明，无水乙醇-20℃保存的标本可以满足后续分子实验需要。由于乙二胺四乙酸(EDTA)可以迅速抑制DNA酶的活性，可以利用EDTA配合乙醇对标本进行保存。季清娥等(2006)研究了不同保存条件对茧蜂标本基因组DNA降解的影响，认为用含50 mmol/L的无水乙醇保存寄生蜂标本可行。利用乙醇固定标本需要特别注意对外骨骼坚硬的昆虫进行处理，防止乙醇被外骨骼阻碍，使得DNA降解。代金霞等(2005)对拟步甲DNA提取研究时发现，提取DNA失败的原因就是由此引起的。

福尔马林(甲醛36%、甲醇8%-12%、游离酸0．02%，极少量的氯化物、硫酸盐、重金属和铁)的优点在于渗透力强、防腐杀菌效果好、固定速度快，能很好地保持生物体形态(徐来祥等，2002;闫晗等，2012)。福尔马林对标本DNA质量的影响因素包括:甲醛在空气中易氧化成甲酸，而甲酸对DNA有较强的降解作用(徐来祥等，2002);福尔马林导致的DNA与生物分子交联阻碍蛋白质被蛋白酶K消化(Arrighi et al．，1968);福尔马林溶液的pH值越低，浓度越高，对DNA的破坏越大(Douglas et al．，1998;Wiegand et al．，1996)。福尔马林对标本DNA扩增也有影响，福尔马林的化学成分都是PCR抑制剂，影响DNA扩增效率(夏颖哲等，2006);福尔马林使固定标本的DNA降解成不同长度的片段，不利于标本DNA进行PCR扩增反应(夏颖哲等，2006);同时，福尔马林使核苷酸分子之间形成抑制DNA双链变性的亚甲基，导致PCR反应中止(庞俊峰和张亚平，2001)。

福尔马林保存的组织样品基因组DNA的破坏程度与保存时间没有直接关系，主要与保存液是否与空气发生氧化有关(徐来祥等，2002;闫华超等，2011)。用福尔马林溶液保存样品时应当注意密封，避免与空气接触。在昆虫领域，从福尔马林固定的标本中提取DNA进行分析的报道很少。很多研究表明，福尔马林作为固定剂保存标本不利于核酸水平的分子试验(徐来祥等，2002;闫华超等，2011;闫晗等，2012)。

根据已有研究，为了能够满足分子系统学的研究，要选择合适的标本保存方式，减少标本保存过程中DNA的损失，提高DNA提取的质量。对于需要做成干标本的昆虫，在制作过程中要采取合适的干制方式，尽量缩短死亡到完全干燥的时间(张建珍等，2004)。标本制作完成后应保存在通风干燥的环境中。对于昆虫浸渍标本，应减少使用福尔马林，而选择适宜浓度的乙醇作为固定剂，并辅之EDTA，达到长久保存标本DNA的目的。

3 昆虫标本DNA提取前的预处理

参考以往的大量研究，常规提取鲜活标本DNA的方法不能很好地适用于馆藏标本，昆虫标本的预处理对提高标本DNA提取质量影响很大(朴美花等，2002;张建珍等，2004;胡艳红等，2006)，是提高昆虫标本DNA提取质量的关键。对于干制的昆虫标本来说，其预处理主要是减少外源DNA污染的可能性(主要是微生物、制作者和制作过程中的外源DNA)。一般选择提取样品内部组织，其处理比较简单。朴美花等(2002)提出了一种提取膜翅目干标本DNA的方法，提取前先把标本放入 STE 缓冲溶液(0．1 mol/L NaCl，10 mmol/L Tris·Cl pH 8．0，1 mmol/L EDTA pH 8．0)中浸渍，然后用冲洗缓冲溶液(10 mmol/L Tris·Cl pH 8．0，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L MgCl2)冲洗，可以大大减少基因组DNA的机械断裂，有利于保护干标本基因组DNA。胡艳红等(2006)在对天牛基因组DNA提取方法的研究中也认同这种处理。

昆虫浸渍标本的预处理要根据不同的浸泡液来决定，通常都是以除去固定剂为目的。对于乙醇浸渍标本来说，起初认为，可根据乙醇不同浓度来选择处理方法:乙醇浓度大于75%则用蒸馏水浸泡30 min;小于75%可以直接提取(庞俊峰和张亚平，2001)。后来通过实验得出，用0．9%NaCl溶液、PBS溶液代替蒸馏水进行一定时间的预处理，有利于高浓度乙醇长期保存标本DNA的提取(张德华等，2004)。梁娟等(2007)通过试验认为，用TE缓冲液进行预处理，有利于高浓度乙醇长期保存的标本DNA的提取。闫晗等(2012)通过试验也认为，利用缓冲液可以提高DNA的获得率。利用缓冲液进行预处理，有利于细胞温和地部分恢复原来的生理环境，有利于细胞内DNA和蛋白质分子之间交联的解离，为后期DNA提取创造条件(张德华等，2004;闫晗等，2012)。

根据庞俊峰等(2001)和夏颖哲等(2006)的研究，对福尔马林预处理的基本方法有:利用PBS、TE、GTE等缓冲溶液降低福尔马林的含量;用不同浓度的乙醇溶液来替换福尔马林，从而降低福尔马林的含量;在替换液中加入福尔马林的结合剂(如甘氨酸(Gly));高温加热处理减轻福尔马林对PCR扩增的抑制作用;真空干燥处理降低标本中福尔马林的含量。因此，可以根据试验需要选择一种或几种预处理方法，提高获得DNA的质量。

4 昆虫标本DNA提取方法

成功的核酸分离纯化需要四个重要的步骤:组织或细胞的破碎和裂解，核蛋白复合体的变性，核酸酶的灭活以及污染物的去除(刘洪波等，2011)。常用于昆虫DNA提取的方法有以下几种:

酚抽提法。Blin等(1976)建立的酚抽提法。该方法是利用 EDTA和十二烷基硫酸钠(SDS)裂解细胞，经蛋白酶K处理后，用pH 8．0的三羟甲基氨基甲烷(Tris)饱和酚反复抽提DNA达到要求纯度后，进行透析或沉淀处理，获得所需的DNA。后来发展改用酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)混合液提取纯化核酸。

改良CTAB法。Murray等(1980)发明了溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)法，其机理是利用CTAB在低盐溶液中能和核酸结合形成沉淀，在高盐溶液中具有可分离特性来进行DNA提取。此法开始用于植物DNA提取，后来与其他方法结合来提取动物基因组。Nie等(2008)发明的SDS-CTAB结合法是一个典型的代表。利用高浓度盐离子和SDS除去蛋白和多糖，然后用低浓度盐离子和CTAB进一步纯化DNA。改进后的SDS-CTAB法提取的 DNA，具有纯度高，无蛋白质和RNA污染的优点(张丽等，2011)。

异硫氰酸胍(GuSCN)法。Boom等(1990)发明异硫氰酸胍法。此法是利用核酸在高浓度的GuSCN条件下，能与硅颗粒结合并在较高温度下被洗脱出的特性建立的。

碱裂解法。Birnboim等在1979年发明碱裂解法，其原理是基于碱性溶液十二烷基硫酸钠(SDS)会使细胞壁破裂，蛋白质和染色体DNA变性的特性。此法结合柱离心法，产生了现今常使用的DNA提取试剂盒，其特点是:高盐酸性缓冲液存在时可特异性吸附DNA，除去RNA与蛋白质等不能结合的杂质，而低盐碱性缓冲液可洗脱结合在吸附柱上的DNA(张丽等，2011)。

随着分子生物技术的发展，DNA提取技术有了新的突破——核酸固相提取纯化技术。与常规方法相比，在提高DNA纯度方面有很大的优势。固相系统抽提核酸依赖缓冲液的pH值和盐浓度来吸附核酸，其吸附过程基于以下原理:在离液条件下氢与亲水基质发生相互结合作用，在水溶液中则通过阴离子交换柱发生离子交换，以及通过亲和力和大小排除机制(刘洪波等，2011)。此方法常用的固相基质有二氧化硅基质，磁珠和阴离子交换介质。常虹等(2013)采用经典的酚仿抽提法、改良的CTAB法、SDS法及动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒(即磁珠法)4种方法提取小蠹基因组DNA，结果在选择的这4种提取方法中，仅磁珠法适合多年保存标本DNA的提取。郑斯竹等(2012)应用磁珠法对实验室多年保存的天牛浸渍标本与干标本进行了微量DNA提取，认为此法完全适合多年保存标本的微量DNA提取。磁珠法作为新兴的DNA提取方法，能够快速、高效的从血液、唾液、组织、细胞等中提取纯度较高的DNA(Xin et al．，2004;Nakagawa et al．，2006)，已广泛用于医学、法医学、分子生物学等领域(郑斯竹等，2012)。这种新技术还需要在其他目科昆虫上进行DNA提取试验，期待这种方法可以适用于所有标本DNA的提取。

根据已发表的相关文献，虽然已有很多提取昆虫标本DNA的方法，但是迄今为止还没有一种通用的提取方法，适用于长期保存的昆虫标本DNA的提取。因而，不同的标本还应根据标本的保存状态和不同试验目的，选取不同的提取方法，才能保证研究的顺利进行。

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