HIF-1、MGMT、CD133在人胶质母细胞瘤中表达的相关性研究☆

邢鹏辉吕中强张学新刘海英佟静刘英姿张磊袁江伟

·论 著·

HIF-1、MGMT、CD133在人胶质母细胞瘤中表达的相关性研究☆

邢鹏辉*吕中强△张学新*刘海英*佟静*刘英姿*张磊*袁江伟*

目的 研究HIF-1、MGMT、CD133在人低级别胶质瘤及胶质母细胞瘤细胞中的表达差异及三者在胶质瘤母细胞瘤中表达的相关性。方法 收集自2010年12月至2012年12月手术切除病理证实的胶质母细胞瘤（WHOⅣ级）33例作为实验组，同期收集低级别胶质瘤25例（WHOI-II级）作为对照组，收集脑深部肿瘤皮层造瘘正常脑组织5例作为阴性对照组。检测不同组别组织中HIF-1、MGMT、CD133的表达，应用SPSS 13.0进行分析。相关统计分析采用Spearman等级相关分析。结果 在正常脑组织中HIF-1、MGMT、CD133不表达，在低级别胶质瘤组和胶质母细胞瘤组中其阳性表达率差异具有统计学意义(P＜0.05)。通过RT-PCR法分别测定HIF-1、MGMT、CD133在正常脑组织、低级别胶质瘤及胶质母细胞瘤中mRNA的相对定量表达，进行相关性分析，三者均存在正相关(HIF-1与MGMTr=0.91,P＜0.05;HIF-1与CD133r=0.85,P＜0.05;MGMT与CD133r=0.80,P＜0.05)。结论 HIF-1、MGMT、CD133阳性表达率随肿瘤级别增高呈显著升高，在胶质母细胞瘤中其表达呈正相关，提示三者在胶质母细胞瘤的发生、发展过程中存在协同作用，为胶质母细胞瘤的治疗提供新的方向。

胶质母细胞瘤 低氧诱导因子1 O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶 CD133、相关性

低氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）是一种核转录因子，主要调控组织细胞对氧的反应状态，在多种肿瘤组织中均有表达，尤以细胞氧浓度减低时表现为高表达，与肿瘤的发生和发展密切相关；CD133已经证实在多种肿瘤干细胞中均有表达，其表达特性与肿瘤细胞分化程度相关，分化程度愈低表达愈高，而在完全分化细胞中几乎不表达；O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）能将DNA鸟嘌呤O6上的烷基转移至自身的半胱氨酸残基上，使DNA上烷基化的鸟嘌呤还原，对于机体具有可以解除烷化剂对细胞的致癌作用以及消除烷化类药物对细胞的毒性杀伤作用。高级别胶质瘤尤其是胶质母细胞瘤临床治疗效果差，如何提高胶质母细胞瘤的综合治疗效果，延长患者生存期是目前神经外科研究的重点及难点。本研究对HIF-1、MGMT、CD133在低级别胶质瘤及胶质母细胞瘤中的表达差异及相关性进行探讨，试图为胶质母细胞瘤更加有效的治疗提供新的研究方向。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集自2010年12月至2012年12月河北医科大学第四医院神经外科手术切除病理证实的多形性胶质母细胞瘤（WHOⅣ级）33例作为胶质母细胞瘤组，同期收集低级别胶质瘤25例（WHOI-II级）作为对照组，收集脑深部肿瘤皮层造瘘正常脑组织5例作为阴性对照。胶质母细胞瘤组、低级别胶质瘤组患者入院前均未进行放疗、化疗、免疫治疗等治疗方法，入院后行头部MRI强化检查，证实病变存在。胶质母细胞瘤组33例患者中男19例，女14例，年龄27～66岁，平均年龄（41.3±3.5）岁。低级别胶质瘤组25例患者中男13例，女12例，年龄31～68岁，平均年龄（45.2±4.0）岁。

1.2 免疫组织化学S-P法检测HIF-1、MGMT、CD133的表达 由两位长期从事免疫组化实验的资深医生双盲法观察，操作步骤按说明书进行，用已知阳性表达切片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。判断HIF-1蛋白、MGMT蛋白的表达在细胞核或细胞浆中呈黄色或棕黄色颗粒状，而CD133为跨膜蛋白，以细胞膜和细胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性表现。先在低倍镜下观察大致染色情况，然后观察5个高倍视野（10×40倍），计算100个肿瘤细胞中阳性细胞平均百分数进行计分。0～5%为0分；＞5%～25%为1分；＞25%～50%为2分；＞50%～75%为3分；＞75%为4分。染色强度以多数阳性细胞呈现的染色特征为标准计分，细胞未着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分，最终综合两者总分进行结果判定。0～1分为阴性；2～3分为弱阳性，4～5分中度阳性；6～7分为强阳性。

1.3 RT-PCR法检测胶质母细胞瘤中HIF-1、MGMT、CD133 mRNA相对定量表达 综合相关资料设计引物。HIF-1引物：5’-CTTTCTTG⁃GAAACGAGTAAAAGG-3’（上游）,5’-TGAGTA⁃ATTCTTCACCCTGCAG-3’(下游)；MGMT甲基化引物：5’-TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC-3’(上游)，5’-GCACTCTTCCGAAAACGAAACG-3’(下游)，CD133引物：5’-TTACGGCACTCTTCACCT-3’(上游),5’-TATTCCACAAGCAGCAAA-3’(下游)，HIF-1、MGMT、CD133扩增条件有所不同。HIF-1扩增：最适宜温度94℃预变性5min，94℃变性30s循环35次、62℃退火1min、72℃1min，延伸10min，终止。MGMT甲基化特异性扩增：最适宜温度96℃预变性10min，96℃变性40s循环35次、59℃退火30s、72℃20s，延伸10min，终止。CD133扩增：最适宜温度94℃预变性4min，94℃变性20s循环35次、60℃退火25s、72℃20s，延伸10min，终止，扩增产物均在恒温4℃下进行封装。将20µLPCR扩增产物及部分上样缓冲液进行搅拌后补充到溴化乙啶（EB）的2%琼脂糖凝胶电泳中，通过凝胶成像分析仪对其进行照相，以表达恒定的管家基因（βactin）作为参照，测定获得目的基因相对于参照基因的相对表达定量值。记录测定的不同级别胶质瘤中HIF-1、MGMT、CD133表达的相对定量值，进一步分析其表达差异，并探求三者间在胶质母细胞瘤中表达的相关性。

1.4 统计学分析 应用SPSS13.0进行分析，分别对HIF-1、MGMT、CD133在实验组和对照组中的阳性表达率采用χ2检验，RT-PCR法测定HIF-1、MGMT、CD133 mRNA相对表达定量值采用t检验或校正t检验（根据方差齐性不同），对三者间的相关性采用斯皮尔曼（spearman）等级相关分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 HIF-1、MGMT、CD133的表达 在正常脑组织中HIF-1、MGMT、CD133均阴性表达，在低级别胶质瘤组中呈低表达，在胶质母细胞瘤组呈高表达（图1～3）。随肿瘤级别升高，HIF-1、MGMT、CD133表达 显 著 升 高（ χ2HIF-1= 22.622,χ2MGMT=6.680,χ2CD133=28.547；P均＜0.05)，见表1。

表1 HIF-1、MGMT、CD133在不同级别胶质瘤及正常脑组织中的表达

2.2 胶质母细胞瘤中HIF-1、MGMT、CD133 mRNA相对定量表达 在不同级别胶质瘤中HIF-1、MGMT、CD133 mRNA的相对定量表达见图4。在胶质母细胞瘤中HIF-1、MGMT、CD133 mRNA的相对定量（0.87±0.12）、（0.67±0.09）、（0.57± 0.08），在低级别胶质瘤中HIF-1、MGMT、CD133 mRNA的相对定量（0.23±0.05）、（0.27±0.07）、（0.16±0.05），HIF-1(t=-79.784)、MGMT(t’=-52.271)、CD133(t=-8.8

图1 不同级别胶质瘤及正常脑组织中HIF-1的表达（SP×400）A：正常脑组织；B：低级别胶质瘤；C：胶质母细胞瘤

图2 不同级别胶质瘤及正常脑组织中MGMT的表达（SP×400）A：正常脑组织；B：低级别胶质瘤；C：胶质母细胞瘤

图3 不同级别胶质瘤及正常脑组织中CD133的表达（SP×400）A:正常脑组织；B：低级别胶质瘤；C：胶质母细胞瘤

图4 RT-PCR分析HIF-1、MGMT、CD133 mRNA表达A:HIF-1;B: MGMT;C:CD133 mRNA

12)mRNA的相对定量两组之间有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 胶质母细胞瘤中HIF-1、MGMT、CD133 mRNA相对定量表达的相关性分析 对HIF-1、MGMT、CD133在胶质母细胞瘤中的相对定量表达进行相关性分析，三者均存在正相关(HIF-1与MGMTr=0.91,P＜0.05;HIF-1与CD133r=0.85,P＜0.05;MGMT与CD133r=0.80,P＜0.05)。

3 讨论

低氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）在脑胶质瘤中的高表达可促进肿瘤血管形成的相关基因表达升高，诱导血管内皮细胞发生增殖，增加血管通透性，增加血管外纤维性凝胶，支持肿瘤血管内皮细胞增殖，使得胶质瘤细胞尤其是脑胶质瘤干细胞在缺氧条件下仍能保持生长、分裂活性，对于胶质瘤干细胞的自我分化、更新、代谢及细胞凋亡均有重要作用[1]。同时HIF-1可以诱导DNA双链断裂修复酶表达，降低凋亡潜能细胞的选择作用，促进化疗药耐药基因的表达使得包括胶质瘤细胞在内的多种肿瘤细胞对放化疗敏感性降低[2-4]。O6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(O6-methy l-guanine-DNA-methylt ransferase, MGMT)是细胞中负责修复DNA损伤的一种酶,可以导致肿瘤细胞对烷基化药物产生耐药。胶质瘤干细胞（glioma stem cells,GSC）存在于各种级别脑胶质瘤中，其标志物CD133阳性表达增高，预示肿瘤恶性度高、术后患者无进展生存期（progreesi⁃on-free survival,PFS）缩短、肿瘤复发加快[5]。同时发现CD133表达是独立于病理级别及其他临床变量的预后因子，有助于评估胶质瘤的生物学行为和评定患者预后。CD133的特异性使得针对CD133表达阳性细胞的靶向治疗研究成为热点，并取得一定进展，对于胶质瘤尤其是高级别胶质瘤的治疗提供新的方向[6，7]。

本试验研究发现在正常脑组织中HIF-1、MG⁃MT、CD133不表达，在低级别胶质瘤中呈低表达，在高级别胶质瘤中呈高表达，统计学分析发现随肿瘤级别升高其表达阳性率具有显著性差异（P＜0.05）。张明阳等[2]研究发现随肿瘤级别升高，HIF-1呈强阳性表达，预示肿瘤恶性程度高，进展迅速，预后差。而喻光等[3]研究中发现同种放疗方法的条件下患者生存期差异明显，HIF-1阳性表达者生存期明显缩短，具有统计学意义。李庆斌等[8]发现MGMT酶活性水平对肿瘤细胞自身功能有明显影响，MGMT阳性表达肿瘤细胞自身功能明显高于阴性表达肿瘤细胞。孔令军等[9]测定CD133在不同级别胶质瘤中的表达发现随肿瘤级别升高，阳性表达显著增高，与本试验所得数据近似。HIF-1、MGMT、CD133在高级别胶质瘤中的高表达预示此类胶质瘤尤其是胶质母细胞瘤恶性程度高，进展迅速，易复发，预后差的特性[8-10]。

HIF-1、MGMT、CD133在胶质母细胞瘤中mRNA相对定量表达的相关性分析，发现三者间均存在正相关，提示在胶质母细胞瘤的发生、发展、治疗后肿瘤进一步的演变进程中三者具有协同作用。徐忠烨、仇志坤等多名学者[11，12]研究已经证实发现扩增培养的胶质瘤干细胞对烷基化药物耐受性高于原代胶质瘤细胞。在临床治疗中我们发现单纯将MGMT阴性表达作为选择替莫唑胺（TMZ）化疗的指标存在一定缺陷，部分MGMT阴性表达胶质瘤患者应用TMZ化疗效果并未优于MGMT阳性表达患者，而部分阳性表达患者应用TMZ化疗仍具有一定效果。而本研究发现在胶质母细胞瘤中CD133呈100%阳性表达，MGMT呈高表达（69.7%），提示存在胶质瘤干细胞层面MGMT的表达阳性率与胶质瘤表达阳性率存在一定差异的可能，即胶质瘤干细胞MGMT阳性表达者在细胞分化过程中在某些因素干扰下进而转为阴性表达，在胶质瘤干细胞中MGMT阳性表达高于胶质瘤。这种现象提示我们是否存在这种可能即干扰三种因子中的一种即可达到影响其他因子的表达的目的，而目前已有研究发现通过应用新型MG⁃MT抑制剂如：干扰素β（IFN-β）、白介素-24（IL-24）、罗曲鲁米等可以下调MGMT的表达活性，可达到增加TMZ对高级别胶质瘤尤其是多形性胶质母细胞瘤的治疗效果的目的[13]。那么我们同样可以通过靶向药物、基因治疗等措施，影响胶质瘤干细胞CD133、HIF-1的阳性表达，是否同样可以降低MGMT的阳性表达，以期能够提高高级别胶质瘤尤其是胶质母细胞瘤对临床常用的烷基化药物敏感性，达到提高治疗效果，延长术后患者无进展生存期。当然此种设想需进一步通过相关研究进行论证，但本试验结论为高级别胶质瘤的治疗尤其是胶质母细胞瘤的有效治疗提供新的研究方向。

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Study on correlations among the expression of HIF-1,MGMT and CD133 in human glioblastoma.

XING Pen⁃ghui,LV Zhongqiang,ZHANG Xuexin,LIU Haiying,TONG Jing,LIU Yingzi,ZHANG Lei,YUAN Jiangwei.Depart⁃ment of Neurosurgery The Fourth Affiliated Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050011,China.Tel:0311-66002972.

Objective To study the expression of HIF-1,MGMT and CD133 in low grade gliomas and glioblastomas and to investigate the correlation among HIF-1,MGMT and CD133 in glioblastomas.Methods All sample tissues were collected from surgeries and pathologically confirmed in Hebei Tumor Hospital between Dec 2010 and Dec 2012.Thirtythree samples of glioblastomas were used as experimental group and 25 samples of low grade gliomas as control group. Five normal cortical tissues from the deep brain tumors were used as negative control group.The mRNA and protein lev⁃els of HIF-1,MGMT and CD133 were examined in various grade glima and normal brain tissue.SPSS13.0 software was used for statistical analysis and differences with a probability value ofP＜0.05 were considered statistically significant and α=0.05 was considered as size of the test.Results There was no expression of HIF-1,MGMT and CD133 in normal brain tissue.In contrast,the expression levels of HIF-1,MGMT and CD133 were statistically significant difference be⁃tween low grade gliomas and glioblastoma(P＜0.05).The correlation analyses showed that there were significant positive correlations among the HIF-1,MGMT and CD133 expression（rHIF-1andMGMT=0.91,P＜0.05;rHIF-1andCD133=0.85,P＜0.05;rMGMTandCD133=0.80,P＜0.05）.Conclusions The expression levels of HIF-1,MGMT and CD133 are significantly elevated with the increase of tumor grade.There are significant positive correlations of expression levels between HIF-1 and MGMT, between HIF-1 and CD133,and between MGMT and CD133,indicating a coordinated effects among among HIF-1α, MGMT and CD133 in the development,recurrence of glioblastoma.The present study provides a new direction for glio⁃blastoma treatment.

Glioblastoma HIF-1 MGMT CD133 Correlation

R739.41

A

2013-03-26）

（责任编辑:甘章平）

10.3936/j.issn.1002-0152.2013.09.003

☆ 河北省卫生厅2012年医学科学研究重点课题（编号：20120384）资助

*河北省石家庄市河北医科大学第四医院神经外科（石家庄 050011）

△ 河北省石家庄市河北医科大学第二医院神经外科

E-mail：zhongqianglv@hotmail.com)