一测多评法测定复方黄白胶囊中大黄蒽醌类成分的含量

孟繁颖方芳雷力力张志国方洪壮

(1佳木斯大学药学院，黑龙江 佳木斯 154007；2佳木斯大学第一附属医院，154003)

一测多评法测定复方黄白胶囊中大黄蒽醌类成分的含量

孟繁颖1方芳2雷力力2张志国2方洪壮1

(1佳木斯大学药学院，黑龙江 佳木斯 154007；2佳木斯大学第一附属医院，154003)

目的：建立一测多评法测定复方黄白胶囊中大黄蒽醌类成分的方法。方法：以复方黄白胶囊为研究对象，以大黄酚作为内参物，计算大黄酸、大黄素和大黄素甲醚与大黄酚的相对校正因子；分别采用一测多评法和外标法测定复方黄白胶囊中上述4种大黄蒽醌类成分的含量。结果：大黄酸、大黄素及大黄素甲醚与大黄酚间的相对校正因子分别为0.946、1.105和1.097，相对校正因子重现性良好。复方黄白胶囊中大黄成分采用校正因子计算的含量值与外标法实测值之间无显著差异。结论：该方法可用于复方黄白胶囊中大黄蒽醌类成分的定量分析。

一测多评；复方黄白胶囊；大黄；蒽醌；相对校正因子

复方黄白胶囊（怡康灵胶囊）为佳木斯大学附属第一医院的院内中药复方制剂，主治由肝郁气滞、脾胃实热、肝胆湿热等症引起的急、慢性胰腺炎，重症胰腺炎。该制剂由大黄、黄芩、白芍等7味中药组成[1]，其中大黄为君药。一测多评法或称“替代对照品法”是中药多成分含量测定的一种新方法[2-4]，该方法可减少对照品使用数目和降低检测成本，已被《中国药典》（2010年版）一部收录[5]。复方黄白胶囊现行的质量标准中，仅测定黄芩苷单一成分的含量[6]。为更有效地控制该制剂的质量，本文应用一测多评法，以大黄酚为内参物，430 nm为测定波长，计算大黄素、大黄酸和大黄素甲醚的含量，建立了复方黄白胶囊中大黄蒽醌类成分的含量测定方法，并与外标法的实测值进行比较。

1 仪器与试药

Agilent 1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司），包括 G1311A四元泵，G1322真空脱气机，G1329自动进样器，G1315二极管阵列检测器（DAD）；Waters Alliance高效液相色谱仪（美国Waters公司），包括2695溶剂和样品管理系统，2996 DAD。色谱柱：Agilent SB C18、XDB C18、Extend C18，规格均为（4.6 mm×250 mm，5 μm）。大黄酚（110796-200310）、大黄素（110756-200110）、大黄酸（110757-200206）供含量测定用；大黄素甲醚（110756-200408）供鉴定用，经峰面积归一化法测定，纯度为97.7%。上述4种大黄蒽醌对照品购自原中国药品生物制品检定所。流动相甲醇为色谱醇，其他试剂均为分析纯。复方黄白胶囊由佳木斯大学附属第一医院药剂科提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Agilent SB C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相甲醇-0.2%磷酸水（82∶18），流速1.0 mL/min，柱温25℃，检测波长430 nm，进样量20 μL。理论板数按大黄酚计不低于4 000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 取大黄酚、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，用甲醇溶解，配置成 96、12、16、18 mg/L的混合贮备液，保存于4℃冰箱中。用时精密量取适量体积用甲醇稀释成混合对照液。

2.2.2 供试品溶液 取复方黄白胶囊内容物 1 g，精密称定，置于50 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称重，加热回流1 h，放冷，称重，用甲醇补足失重，摇匀，滤过，精密量取续滤液20 mL，蒸干，残渣加入1.5 mol/L盐酸20 mL，回流提取30 min，放冷，再加入三氯甲烷20 mL，加热1 h，放冷，移至分液漏斗中，静置，取三氯甲烷层，酸液用三氯甲烷萃取3次，每次20 mL，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂，残渣加甲醇溶解，转移至10 mL容量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液 按复方黄白胶囊制备工艺制取缺大黄的阴性样品，按 2.2.2项下供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。

2.3 色谱峰的定位

取混合贮备液5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度使成混合对照液。分别取供试品溶液、混合对照液及阴性对照液，按2.1项下色谱条件测定，同时记录各色谱的230～ 480 nm的数据。各溶液430 nm的色谱图见图1。提取对照品色谱峰二维数据的光谱，作为标准光谱，分别计算其与供试品溶液部分保留时间光谱间的相关系数，并绘制相应的光谱相关色谱曲线[7]，见图2。可知，供试品溶液色谱保留时间5.90、8.74、11.78、15.61 min处的色谱峰分别为大黄酸、大黄素，大黄酚和大黄素甲醚，各色谱峰均为纯峰。

图1 对照品和样品的HPLC图A大黄蒽醌对照品；B复方黄白胶囊供试品；C复方黄白胶囊大黄阴性供试品1大黄酸；2大黄素；3大黄酚；4大黄素甲醚

2.4 线性与范围

分别精密移取混合贮备液1、3、5、6、8 mL置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成系列浓度的混合对照液，按2.1色谱条件测定混合储备液及系列浓度混合对照液。以进样量X（μg）对测得的峰面积Y进行线性回归，得大黄酚、大黄素、大黄酸、大黄素甲醚的回归方程及线性范围，见表1。4种大黄蒽醌类成分在所测定的范围内线性关系良好。

图2 供试液中各成分的光谱相关色谱A大黄酸 B大黄素 C大黄酚 D大黄素甲醚

表1 复方黄白胶囊中4种蒽醌类成分的线性关系（n=6）

2.5 精密度试验

取同一供试品溶液连续进样6次，记录4种蒽醌类成分的峰面积，计算峰面积的RSD。大黄酚、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚的RSD分别为0.2%、0.4%，0.4%和0.3%，仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于配制后的0、2、4、8、12和24 h进样分析，记录 4种成分的峰面积值，计算RSD。大黄酚、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚峰面积的 RSD分别为 0.5%、1.0%，0.9%和0.9%。结果表明，供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 重复性试验

按2.2.2项下方法平行制备6份供试品溶液，分别测定，记录4种成分峰面积，并计算各自的RSD。大黄酚、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚的RSD分别为1.1%，1.8%，1.6%，1.3%。结果表明，测定重复性良好。

2.8 相对校正因子

2.8.1 校正因子确定 取混合贮备液及2.4项下的各混合对照液，分别按2.1色谱条件测定各成分的峰面积。根据相对校正因子公式[3]，分别计算大黄酸、大黄素、大黄素甲醚与内参物大黄酚的相对校正因子，结果见表2。

表2 大黄中蒽醌类成分相对校正因子

2.8.2 校正因子重现性 取混合贮备液，加甲醇等量稀释。分别于两台仪器3种色谱柱上各进样3次，每次进样10 μL，测定各成分的峰面积，按公式计算大黄酸、大黄素、大黄素甲醚对大黄酚的相对校正因子，所得的相对校正因子及RSD见表3，结果显示，不同的仪器及不同的色谱柱所得的相对校正因子较接近。

表 3 不同仪器和色谱柱测得相对校正因子 （n=3）

2.9 回收率

取已知含量的同一批号的复方黄白胶囊内容物6份，各约0.5 g，精密称定，分别置于50 mL具塞锥形瓶中，精密加入对照品混合贮备液3 mL，再精密加入甲醇20 mL，按2.2.2项下自“称重”起操作，制备供试品溶液，按 2.1色谱条件测定，以一测多评法计算各成分的加样回收率。结果大黄酚、大黄酸，大黄素及大黄素甲醚的4种成分的加样回收率分别为98.9%，100.6%，100.4%，99.7%；RSD分别为1.4%、1.6%，1.2%和1.8%，表明该方法有很好的准确性。

2.10 样品测定

取6个不同批号的复方黄白胶囊，分别制备供试品溶液。精密量取混合贮备液6 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度使成混合对照液。将制备好的供试品溶液和混合照液，分别进样测定。分别用一测多评法和外标法计算大黄酚、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚4种成分的含量，结果见表4。对表4中不同方法测得的大黄素、大黄酸和大黄素甲醚含量数据进行成对t检验，结果表明，一测多评法测定的复方黄白胶囊中蒽醌类成分的结果在准确度上与外标法无差异（α=0.1）。

表4 不同方法测得复方黄白胶囊中大黄蒽醌类成分的含量（mg/g）

3 讨论

复方黄白胶囊中大黄蒽醌类成分以结合型糖苷和游离型苷元两种形式存在，为了增加测定的灵敏度，在方法建立和样品测定时，均先将蒽醌的结合型糖苷水解成苷元后，测定各蒽醌苷元成分的含量。采用一测多评法测定含大黄中药制剂中的蒽醌成分，现仅见于三黄片的测定[8]，测定波长为254 nm。复方黄白胶囊所含化学成分复杂，本研究选用的测定波长为430 nm，该波长为大黄蒽醌的吸收峰之一，在此波长下可消除复方黄白胶囊中共存的其他成分对测定的干扰。结果表明，本研究所建立的方法可用于复方黄白胶囊中大黄蒽醌类成分的定量。

[1] 黄展.怡康灵胶囊主要药效学实验研究 [J].黑龙江医药科学，2007，30（3）：47-48.

[2] 王智民，高慧敏，付雪涛，等.“一测多评法”中药质量评价模式方法学研究[J].中国中药杂志，2006，31（23）：1925-1928.

[3] 王智民，钱忠直，张启伟，等.一测多评法建立的技术指南[J].中国中药杂志，2011，36（6）：657-658.

[4] 何欢，马双成，张启明，等.HPLC替代对照品法同时测定莪术油及其注射液中6种成分的含量[J].药物分析杂志，2009，29（11）：1892-1899.

[5] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（2010年版）一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：285.

[6] 董丽华，张志国，于春艳.高效液相色谱法测定怡康灵胶囊中黄芩苷的含量[J].中国药师，2006，9（8）：777-778.

[7] Hu Y，Liang YZ，Li BY，et al.Multicomponent spectral correlative chromatography applied to complex herbal medicines[J].J Agric Food chem，2004，52（26）：7771-7776.

[8] 王钰莹，冯伟红，杨菲，等.“一测多评”法测定三黄片中的大黄蒽醌类成分[J].中国中药杂志，2012，37（2）：212-217.

Content Determination of Rhubarb Anthraquinones in Compound Huangbai Capsules by QAMS

Meng Fanying1，Fang Fang2，Lei Lili2，Zhang Zhiguo2，Fang Hongzhuang1（1 College of Pharmacy of Jamusi University，Heilongjiang Jiamusi 154007，China；2 The First Affiliated Hospital of Jiamusi University，154003）

Quantitative Analysis of Multiple Components with A Single Maker（QAMS）；Compound Huangbai Capsules；Rhubarb；Anthraquinone；Relative Correlation Factor

10.3969/j.issn.1672-5433.2013.02.008

2012-06-04）

黑龙江省教育厅科技研究项目（12521547）；佳木斯大学青年基金项目（S2011-032）

孟繁颖，女，硕士。研究方向：药物质量控制方法学。

方洪壮，男，教授。研究方向：计算药物分析、中药分析。通讯作者E-mail:fhz-chjms@sohu.com

ABSTRCT Objective:To establish a quantitative method for the quantitative analysis of multiple components with a single maker（QAMS）to determine the content of rhubarb anthraquinones in compound huangbai capsules.Methods:Compound huangbai capsules were taken as the research object.Chrysophanol was used as the internal reference and the relative correlation factors（RCFs）of rhein，emodin and physcion to chrysophanol were calculated.The contents of these four anthraquinones were determined by the external standard method and QAMS respectively.Results:The RCFs of rhein，emodin and physcion to chrysophanol were 0.946，1.105 and 1.097 respectively，indicating good reproducibility.No significant differences between the quantitative results of the two methods were observed.Conclusion:The established QAMS method can be applied to the quantitative determination of rhubarb anthraquinones in compound huangbai capsules.