H2O2对新生大鼠心室肌细胞HCN通道电流的影响及其机制

郑明奇，刘 刚，董 梅，吉立双，于 榛

(河北医科大学第一医院心内科，河北石家庄050031)

临床和基础研究表明，心脏病特别是氧化应激条件下，例如心肌缺血和心肌梗死后，恶性心律失常事件的增加主要是由于离子通道和运输蛋白的重构明显地改变了心肌细胞的兴奋性和传导。这种心肌电重构主要表现为心肌细胞离子通道活性，表达以及功能上的显著变化［1］。室性心律失常发生率的增加至少在部分是与超极化激活的环核苷酸门控通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel，HCN)蛋白表达和HCN 通道电流(funny current，If)密度的调控增加相关联［1］。这种“功能获得(gain of function)”的电重构很可能通过希氏束-浦肯野系统的特殊传导纤维增加异位的自动节律性［1］。但是，在疾病状态下，心脏HCN通道活性/功能增强调控的机制尚不清楚。

1 材料与方法

1.1 溶液与试剂

记录全细胞If电流时，细胞外液和电极内液参照文献［2］。

各种蛋白激酶抑制剂(Sigma Aldrich 公司)。过氧化氢使用前溶解于双蒸馏水，其余化学药品溶于二甲基亚砜(DMSO)作为储存液，实验时储存液稀释于细胞外液中，使DMSO 浓度均低于0.1%(不影响细胞膜离子通道功能)。用上述抑制剂进行细胞培养预处理1 h，然后记录HCN 通道电流(If)。

1.2 新生大鼠心室肌细胞制备和细胞培养

本实验得到河北医科大学伦理道德委员会批准，1 ～3 d新生健康清洁级Wistar 大鼠(共5 批，每批8 只)购自河北医科大学实验动物中心(动物合格证号:1202067)。心室肌细胞按照文献所述制备［3］。上述所有细胞于37 ℃，95% CO2的孵育箱中培养以备膜片钳实验和分子生物学实验用。

1.3 全细胞电压钳和电流钳记录

室温(20 ～23 ℃)条件下通过膜片钳技术记录If电流。记录方法和数据分析参照文献［3］。

1.4 Western blot 分析

来自心肌组织样本的蛋白按照标准程序提取细胞膜蛋白［4］，使用酪氨酸特异性磷酸化抗体4G10，用Western blot 技术分析HCN 蛋白的定量表达。简言之，以TE 缓冲液(10 mmol/L三羟甲基氨基甲烷甘油缓冲液，1 μg/mL 抑肽酶，2 mmol/L EDTA，pH 7.0)加1%曲通X-100 对心肌组织样本进行匀浆提取膜蛋白。使用试剂盒(皮尔斯)分析蛋白浓度。然后将所有检测样本蛋白等量加入在10%聚丙烯酰胺凝胶板上进行电泳，然后转膜到聚偏氟乙烯膜，后用TBST 洗膜5 min，3 次，用考马斯亮蓝染色后用水冲洗，经5%牛奶TBS-T 加抗磷酸化HCN2 抗体4G10(1∶1 000稀释)以分析HCN2 通道蛋白磷酸化活性。HCN2 蛋白信号通过增强的化学发光试剂(Pierce Chemical)，使用的UVP 生物成像系统进行分析(Upland，CA)。将HCN2 蛋白除以β-actin 进行标准化定量。

1.5 统计学分析

应用软件(Pulse/PulseFit，V.8.11，HEKA Elektronik)采集并保存数据。数据用均数± 标准差(±s)表示。变量方差分析和克莱默程序(Tukey-Kramer procedure)等用于多重比对，Student's t 检验用于2 组数据间的比较。

2 结果

2.1 H2O2 对新生大鼠心室肌细胞If 电流的影响

H2O2处理前后的心室肌细胞If通道电流(图1)。从－40 mV的保持电位至测试电位－130 mV使膜超极化得到激活的If电流。100 μmol/L H2O2处理30 min 后，If电流显著增加，伴随着对应的电导增大(Gmax)，激活曲线的半数激活电压(V1/2)向除极化方向移动，激活速度(时间常数，τact)增快。

2.2 酪氨酸蛋白激酶对H2O2 增大If 电流的影响

Genistein 或PP2 明显抑制H2O2增大的If电流(图2A);与之相一致的是，H2O2增大的HCN2 通道酪氨酸磷酸化水平也被Genistein 或PP2 明显抑制(P＜0.05)。

2.3 蛋白酪氨酸磷酸酶对If 电流的影响

两种非特异性蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)抑制剂PAO(1 μmol/L)或者Na3VO4(10 μmol/L)均明显增大If电流密度［对照组:(4.7 ± 0.6)pA/pF;PAO 组:(11.7 ± 1.1)pA/pF;Na3VO4组(12.0 ±2.1)pA/pF;P＜0.05］(图3)。

2.4 硫氧还原蛋白系统对H2O2 增大的If 电流的影响

硫氧还原蛋白受体抑制剂金诺芬(auranofin 10 μmol/L)或13-cis-RA(100 μmol/L)明显抑制H2O2作用下增大的If电流(图4)。

3 讨论

氧化应激条件下心脏病患者发生心律失常内在机制主要是心肌电重构，这种心肌电重构主要表现为心肌细胞离子通道活性，表达以及功能上的显著变化。本研究使用外源性H2O2显著增大了新生大鼠心室肌If电流，并且这种电流的增大与其编码的通道蛋白磷酸化水平显著增高密切相关。为探讨酪氨酸蛋白激酶在H2O2调控If电流增大机制中的作用，使用非特异性酪氨酸蛋白激酶抑制剂Genistein或者c-Src 蛋白特异抑制剂PP2 显著抑制了H2O2对If电流的增大作用，增大的HCN 通道的酪氨酸磷酸化水平也被显著抑制，暗示了酪氨酸激酶在氧化应激刺激下HCN 通道重构机制中的重要角色。

作为一个对心肌重构起重要作用的因素，氧化应激能够引起细胞蛋白氧化还原状态的可逆或不可逆改变［5－6］。在心肌疾病状态下，氧化应激诱发的氧化还原状态失衡促进了关键调控蛋白的氧化损伤，明显地影响了心肌功能。我们以前的研究已经报道了Trx 系统在心衰大鼠心脏有显著性减弱，这种条件下心肌的电重构是由于细胞内氧化还原状态的转换而引起的，这种氧化应激引起Kv 通道的重构能够通过激活心肌细胞内的Trx 系统被逆转［4，7－8］。为进一步探讨硫氧还原蛋白系统是否介导了外源性氧化因子H2O2调控增大If电流的机制，本研究用硫氧还原蛋白受体抑制剂金诺芬或13-cis-RA 均明显抑制H2O2作用下增大的If电流，暗示了硫氧还原蛋白(Trx)系统在调控氧化应激刺激下HCN 通道重构机制的中枢作用。

疾病状态下氧化应激在细胞和分子水平领域的研究近10年来在国际上和国内不断得到创新发展［4－8］。在缺血和衰竭心脏，氧化应激通过细胞内Trx 系统介导心肌细胞离子通道重构的研究对于预防和逆转以心肌电重构为基础的心律失常是一个全新的方向和突破。本研究显示在氧化剂H2O2刺激下的心室肌细胞If电流增大，是通过活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)依存性的酪氨酸蛋白激酶和硫氧还原蛋白系统，调控HCN 通道的活性和表达，本研究为氧化应激引起的细胞损伤和离子通道重构的调控研究提供了一个新视点，为临床更有效地防治心律失常提供新的理论依据和治疗策略。

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