生长调节剂和基质对紫花苜蓿扦插繁殖效率的影响

张树振，金 樑，周 虹，韩春芳，杨 龙，王晓娟

(兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州 730020)

紫花苜蓿(Medicagosativa)属于异花授粉植物，花粉和种子传播是影响其遗传分化的主要因素，遗传漂变或自然选择而非迁移或基因流是影响其种群分化的主要因素[1]。与自花授粉植物相比较，异花授粉植物大多数高频率的等位基因都出现在种群内部，而种群间相似性较高，差异较小，导致种群间的变异相对小于种群内部[2-3]。异花授粉植物的高度杂合性和异质性，使得在其更新繁殖过程中如何保持其原有的遗传完整性(Genetic Integrity)成为目前国内外探讨的热点问题[4]。

紫花苜蓿作为多年生豆科牧草，因其营养价值高、适口性好，被誉为“牧草之王”，加之苜蓿具有抗寒、耐旱、耐盐碱等优点，在改善生态环境、退耕还草以及调整农业产业结构中具有重要作用[5]。鉴于此，培育生产品质优良、生态适应性强的苜蓿新品种显得十分迫切，而利用雄性不育特性获得杂种优势是培育高产、优质、抗逆性强的苜蓿品种的有效途径[2,6]。研究发现，紫花苜蓿经过两轮以上的自交会出现严重的自交衰退现象[6]，因此，为了获得保持遗传完整性的材料用于进一步的研究和育种等，有必要对特定单株材料进行扦插繁殖。其中，茎段扦插是苜蓿最常采用的扦插繁殖方式，对于扩繁优良单株用于杂交制种等具有重要意义[7-8]。

影响插穗扦插繁殖效率的因素包括植物自身特性和外部因子，前者包括插穗发育时期、生长部位及切口处理等，而后者主要包括外源生长调节剂、栽培基质和环境因子如温度、湿度和光照等。研究发现，苜蓿不同部位茎段和插穗基部切口方式对其扦插克隆效率均具有显著影响，以中部节间扦插的效果最好[9]，而插穗发育时期以现蕾初期扦插成活率最高，达97.2%[10]。与此同时，外源植物生长调节物质通过促进扦插枝条内部营养物质重新分配和内源激素的表达提高插穗植物细胞内渗透压、吸水能力和酶活性，进而使细胞顺利进行脱分化和再分化，促进插条生根[11]。目前，有关紫花苜蓿扦插繁殖影响因素的报道较少，尚未建立高效成熟的扦插繁殖技术体系。本研究以前期筛选鉴定的紫花苜蓿雄性不育突变体ms1[12]为研究材料，对影响苜蓿插穗成活的外源生长调节剂和基质配方进行系统研究，并建立苜蓿优良种质材料扩繁体系，以期为加快其良种繁育速度提供理论依据。

1 材料与方法

1.1供试材料 试验材料为温室种植生长两年的紫花苜蓿雄性不育突变体ms1，于孕蕾初期选取健壮无病植株中部节间进行试验。

1.2试验设计 苜蓿插穗一芽一节，插穗长度6～7 cm，上部剪成平茬，基部剪成斜茬，不带叶片[9]。使用前消毒处理育苗盘，扦插深度为3～4 cm。试验在兰州大学智能温室内进行，光照时间16 h·d-1，光照强度>600 μmol·m-2·s-1，白天温度24～26 ℃，夜间温度18～20 ℃，相对湿度50%～60%。所有插穗按照温室常规管理方法进行，保持基质表面湿润，试验期间未发生病虫害。

1.2.1不同生长调节剂及其浓度梯度 选用吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)和生根粉(ABT)作为苜蓿茎段扦插繁殖生根生长调节剂，每种生长调节剂分别设置50、100、150 mg·L-1共计3个浓度，采用蒸馏水作为对照处理(CK)，插穗基部在以上处理液中处理1 h，扦插基质为160 ℃干热灭菌4 h的蛭石，每个处理设3次重复，每个重复20个插穗。

1.2.2不同栽培基质配比 采用5种栽培基质配方，包括两种单一基质M1(园土)和M2(蛭石)，以及3种复合基质M3(河沙∶蛭石=1∶1，体积比，下同)、M4(蛭石∶园土∶珍珠岩=3∶1∶1)和M5(园土∶河沙∶珍珠岩=7∶2∶1)。所有基质使用前经160 ℃干热灭菌4 h，插穗采用100 mg·L-1ABT溶液处理1 h。每个处理设3次重复，每个重复20个插穗。

1.3测定指标 扦插30 d后测定各处理条件下苜蓿插穗成活率、生根数、根长和叶数量，并按照以下公式计算根系效果指数[13]：

根系效果指数=(平均根长×根系数量×生根率)/生根插穗数。

1.4数据处理 所有数据均以平均值±标准误表示。采用SPSS(v17.0)软件分别对生长调节剂和基质处理进行单因素方差分析，采用Duncan新复极差法检验处理进行多重比较，P<0.05表示差异显著。

2 结果

2.1生长调节剂对紫花苜蓿插穗成活率的影响 不同浓度IBA、NAA和ABT处理后苜蓿插穗的成活率不同，其中，150 mg·L-1ABT处理的插穗成活率最高，达88%，比对照高71.0%，150 mg·L-1IBA处理的插穗成活率最低，仅为35%(图1)。方差分析表明，50和150 mg·L-1ABT处理的插穗成活率显著高于其余处理组(P<0.05)，不同浓度的ABT处理插穗的成活率也均显著高于对照；而不同浓度的IBA处理，除150 mg·L-1IBA处理的插穗成活率显著低于对照外，其余两个处理浓度均与对照无显著差异(P>0.05)。对于NAA处理，除50 mg·L-1NAA处理的插穗成活率与对照无显著差异外，其余两个处理浓度下插穗的成活率均显著高于对照。这说明该浓度梯度下NAA和ABT对紫花苜蓿插穗生根成活的促进作用优于IBA。

图1 不同生长调节剂处理条件下紫花苜蓿的插穗成活率Fig.1 The survival rate of alfalfa cuttings under different growth regulators treatments

2.2生长调节剂对紫花苜蓿插穗生长性状的影响

2.2.1不同浓度IBA、NAA和ABT处理对紫花苜蓿插穗生根数的影响 除150 mg·L-1NAA处理的成活插穗生根数高于对照外，其余处理均低于对照，其中以50 mg·L-1IBA处理的扦插成活枝穗的生根数最少，仅为1.95条，较对照降低112%(表1)。

表1 不同浓度IBA、NAA和ABT处理对紫花苜蓿扦插效果的影响Table 1 Propagation effects of alfalfa cuttings treated by different concentrations of IBA, NAA and ABT

方差分析表明，150 mg·L-1IBA处理插穗的平均生根数与100 mg·L-1IBA处理无显著差异(P>0.05)，150 mg·L-1NAA处理的扦插生根数显著高于50 mg·L-1IBA处理和100 mg·L-1NAA处理(P<0.05)，其余各处理间无显著差异。

2.2.2不同浓度IBA、NAA和ABT处理对紫花苜蓿插穗根长的影响 100 mg·L-1IBA和100 mg·L-1NAA处理成活插穗的平均根长最长，为9.96 cm，平均根长最低的是50 mg·L-1IBA处理，仅为5.19 cm(表1)。方差分析表明，150 mg·L-1IBA处理的插穗根长与其它IBA处理间无显著差异(P>0.05)，50 mg·L-1IBA处理显著低于100 mg·L-1的IBA处理(P<0.05)；150 mg·L-1NAA处理株的平均根长显著低于其它NAA处理；而ABT各浓度之间无显著差异。50 mg·L-1IBA、150 mg·L-1NAA及100 mg·L-1ABT处理对插穗的平均根长均显著低于对照。

2.2.3不同浓度IBA、NAA和ABT处理对紫花苜蓿插穗叶片数量的影响 对照处理的叶片数量高于各生长调节剂处理，为12.12枚，100 mg·L-1NAA处理插穗的叶片数量最低，仅为7.00枚(表1)。方差分析显示，100 mg·L-1IBA处理显著低于150 mg·L-1IBA处理(P<0.05)，两者与50 mg·L-1IBA处理均无显著差异(P>0.05)。NAA各处理浓度之间无显著差异。100 mg·L-1ABT处理显著低于其余ABT处理(P<0.05)。100 mg·L-1IBA、100和150 mg·L-1NAA及100 mg·L-1ABT处理插穗的叶片数量均显著低于对照。

2.2.4不同浓度IBA、NAA和ABT处理对紫花苜蓿插穗根系效果指数的影响 对照处理的根系效果指数最高，为0.82，其次是100 mg·L-1IBA处理，50 mg·L-1IBA处理根系效果指数最低，仅为0.23(表1)。方差分析表明，除50 mg·L-1IBA和100 mg·L-1ABT处理的根系效果指数显著低于对照外(P<0.05)，其余各处理与对照均无显著差异。

2.3不同基质配方对紫花苜蓿插穗成活率的影响 5种基质配方条件下紫花苜蓿扦插成活率差异较小(图2)，其中，基质M3上插穗的成活率最高，达79.0%，基质M1插穗成活率最低，为64.7%。统计分析表明，M1、M2、M3、M4和M5这5种扦插基质苜蓿插穗成活率差异不显著(P>0.05)。

2.4不同基质配方对紫花苜蓿插穗生长性状的影响

2.4.1不同基质配方对紫花苜蓿插穗生根数的影响 基质M4上插穗的生根数最多，达3.76条；基质M3上插穗的生根数最少，为2.67条(表2)。统计分析表明，基质M2、M3、M4和M5上插穗的生根数与M1之间均无显著差异(P>0.05)，M3上插穗的生根数量显著低于基质M4和M5(P<0.05)，生根数量依次为M4>M5>M2>M1>M3。

2.4.2不同基质配方对紫花苜蓿插穗根长的影响 基质M2上成活插穗的根长最长，为6.50 cm，M1上成活插穗的根长最短，仅为4.39 cm(表2)。统计分析表明，基质M2上成活插穗的根长显著高于M1(P<0.05)，基质M3、M4和M5上插穗的根长与M1或M2之间均无显著差异(P>0.05)。

图2 不同基质配方对紫花苜蓿插穗成活率的影响Fig.2 The survival rate of alfalfa cuttings on different substrates

2.4.3不同基质配方对紫花苜蓿插穗叶片数量的影响 不同扦插基质对插穗叶片数量影响不同(表 2)，其中基质M5上成活插穗的叶片数量最多，达9.80枚，基质M2上插穗的平均叶片数量最少，为7.20枚。统计分析表明，基质M4、M5和M1上插穗的平均叶片数量均显著高于基质M2处理(P<0.05)。

2.4.4不同基质配方对紫花苜蓿插穗根系效果指数的影响 基质M2的根系效果指数最高，为0.47，其次是基质M4，M1的根系效果指数最低，为0.28(表2)。统计分析显示，基质M2的根系效果指数显著高于M3和M1(P<0.05)，基质M4和M5的根系效果指数与M1、M2和M3之间无显著差异(P>0.05)。

3 讨论

扦插繁殖技术不仅能保证在短时间内获得大量扦插成活苗，而且还能保持植物特有的遗传性质，是植物无性繁殖的重要方法之一。影响插穗成活生根的因素很多，扦插成活率除受到植物自身的生物学特性、插穗的发育程度及外界条件(如温度、湿度、光照等)等因素影响外[14]，处理插穗的生长调节剂种类和浓度以及扦插基质对插穗成活生根也具有重要的影响[11,15]。不同因素对插穗生根效果不同，潘惠忠[16]研究发现，植物生长调节剂种类、浓度、浸泡时间和扦插基质4个因素对桂花(Osmanthusfragrans)生根率的影响大小依次为植物生长调节剂>浸泡时间>浓度>扦插基质。

表2 不同基质配方对紫花苜蓿扦插效果的影响Table 2 Rooting of alfalfa cuttings on different substrates

3.1植物生长调节剂对苜蓿扦插效果的影响 适宜的外源生长调节剂可以促进插穗内部IAA向生根部的运输，改变IAA/ABA比值，并能在愈伤形成期降低GA含量，使内源激素之间达到一定平衡，进而提高插穗的细胞渗透压、吸水性和酶活性，使插穗基部的薄壁细胞脱分化，产生愈伤组织，促进不定根的生成，还可促使养分向插穗基部运输，形成养分吸收中心，从而缩短插穗生根时间、提高生根率、根系质量及移栽成活率[17-18]。耿慧等[8]研究表明，施用IBA-NAA生根剂可明显缩短苜蓿插穗的发芽时间，促进生根，提高分枝数。此外，插穗成活率瑟外源生长调节剂浓度密切相关。如，当外源生长调节剂超过一定浓度后，葫芦茶(Tadehagitriquetrum)插穗成活率随处理浓度的增加而降低[11]。本研究发现，对于NAA而言，除50 mg·L-1NAA处理的插穗成活率与对照无显著差异外，其余处理均显著提高插穗成活率(P<0.05)，而IBA处理对苜蓿插穗成活率无显著促进效应，甚至在150 mg·L-1处理下显著低于对照处理，这可能是由于植物对外源生长调节剂的应用浓度范围要求比较严格，且不同生长调节剂适宜插穗生根的浓度不同，超过一定的量，则会出现毒害现象[19]。因此，在使用植物生长调节剂时，应严格掌握生长调节剂种类和浓度配比。

本研究发现，对照与生长调节剂处理相比，虽然成活率较低，但成活插穗具有较高的生根数、根长、叶片数量及根系效果指数，这与以往研究不同[8,11]。得到以上苜蓿扦插繁殖效果可能存在如下原因：1)未加外源激素诱导而生根的苜蓿插穗具有较强的生长活力和较高营养成分；2)外源生长调节剂虽然能够促进内源激素的表达，但不同时期效果不同，如IBA在扦插初期可诱导根源基的发生，而根源基形成后，则会诱导愈伤组织的大量生成，阻碍根的生长[17,20]。张博等[21]在研究楸树(Catalpabungei)扦插繁殖中发现，最佳生根率和最优生根性状不相关，且生根率和产生愈伤组织的插穗个数之间也未发现明确的对应关系。

3.2栽培基质对紫花苜蓿扦插效果的影响 栽培基质配方是影响扦插效果的重要因素之一，它的透气性、透水性都会对插穗的成活与生根产生重要的影响[22]。本研究发现，100 mg·L-1ABT处理的苜蓿插穗在不同生长基质中成活率差异不显著(P>0.05)，这与占正军等[15]在榉树(Zelkovaschneideriana)中的研究结果一致，其原因可能是植物生长调节剂对插穗生根的影响能力高于基质[16]，施用外源生长调节剂后基质对插穗生根的影响降低了。基质自身特性和插穗生根效果具有密切联系，园土的透气性差，阻碍插穗不定根的形成，所以园土作为单一基质时，插穗的成活率最低。而河沙和蛭石的混合基质插穗成活率最高，是由于蛭石本身是一种保温材料，作为扦插基质时有利于提高苗盘内温度，而且其透气性好，再加上河沙较好的透水性，能够避免因基质含水量过高而引起插穗腐烂，所以成活率高。

综合各种基质对苜蓿插穗生长效果的分析可知，不同基质配方处理对紫花苜蓿插穗的生根数、根长、叶片数量及根系效果指数影响不同。复合基质优于单一基质，主要原因是园土中含有一定的营养物质，可保证插穗后续生长过程中养分的供给，且持水保水能力强并能固定插穗，但透气性差；蛭石具有透气保水、含菌量低、离子交换能力强等优点，但营养匮乏，固定能力差导致物理性能容易破坏；河沙透气排水性好，但保温性能差，缺乏营养；珍珠岩具有较好的透气保水性能，质轻有利于插穗生根，但其缺乏营养且离子交换能力差；而复合基质可以集合多种基质的优点，克服单一基质的不足，既能为苜蓿插穗提供良好的生存环境，又能保证插穗后期生长的营养供给，进而提高插穗的扦插繁殖效率。

4 结论

本研究发现，适宜的外源生长调节剂的施用可以提高紫花苜蓿扦插效率，其中以ABT效果最好，NAA次之，IBA效果最差，而且以150 mg·L-1ABT处理效果最佳。5种栽培基质处理在紫花苜蓿扦插成活率无显著差异(P>0.05)，但对插穗的后续生长有一定的影响，混合基质的效果优于单一基质，河沙+蛭石成活率最高，园土+蛭石+珍珠岩和园土+河沙+珍珠岩的成活率较高，后续生长效果好，园土效果最差。

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