紫花苜蓿的航天诱变

杨红善，常根柱，包文生

(1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃 兰州 730050； 2.甘肃省航天育种工程技术中心，甘肃 天水 741030)

紫花苜蓿(Medicagosativa)是多年生的优良豆科牧草，其营养价值高，生产潜力大，用途广泛，在我国草产业发展中十分重要。紫花苜蓿产业被誉为“牛奶生产的第一车间”，据相关报道，按科学标准，用紫花苜蓿干草饲喂奶牛，可以使原料奶的乳蛋白率超过3.0%，乳脂率超过3.5%，这个指标大大超过当前的国家标准(2.75%)，并与国际标准接轨[1-2]。针对我国目前气候变化异常、紫花苜蓿当地品种及老品种病虫害严重、产量低、品质差的现状，筛选或培育适应生产发展要求，具优质、高产、抗旱、抗寒、耐瘠薄的紫花苜蓿品种迫在眉睫。同时，紫花苜蓿为多年生、异花授粉植物，遗传背景复杂，遗传改良有很大难度，传统的育种方法周期长、转基因育种难度大，因此寻找一种较为快捷有效的育种方式尤为重要。采用高端的空间技术与常规农业育种技术相结合，则是一种具有高创新型的育种研究，航天诱变育种是以高科技为背景的新兴育种方法，我国的航天育种走在世界前列，主要集中于农作物和蔬菜[3]，牧草航天育种近几年刚刚起步，主要集中于紫花苜蓿方面的研究。应用航天诱变技术，培育具有自主知识产权的优质、高产、安全的牧草航天诱变新品种、新品系和育种新材料，可加快推动我国草产业的发展。

1 航天诱变育种

1.1航天诱变育种的定义 航天诱变育种是以高科技返回式卫星为平台的新兴育种方法，指将植物种子或其他生命体，搭载于神舟飞船等返回式航天器，利用空间的特殊环境(如空间宇宙射线、高真空、微重力、弱磁场等因素)综合作用，引起生物体染色体畸变，导致生物体遗传变异，地面种植，获得有益突变体，选育新品种、新品系和新材料的植物育种技术[3]。

1.2航天诱变的机理 航天诱变是高真空、微重力、空间辐射及太空未知诱因的综合作用，包括以下3方面：1)宇宙射线、高能离子、宇宙其他物质照射种子胚芽，导致DNA双链断裂重组，从而使遗传信号改变；2)航天器上升、回落、失重、微重力等环境可改变染色体结构，使得紧凑螺旋状的染色体拉长，导致遗传信号改变；3)其他许多太空未知诱因，这些因子正在研究过程中[4-9]。

1.3航天诱变育种的特点 诱变频率高，变异幅度大，缩短育种周期。特殊的太空环境能诱发作物种子产生遗传变异，诱变种子地面种植后，变异类型多，变异幅度大，多数变异性状在后代能稳定遗传，可加快育种进程，一般在SP4代即可稳定，比常规育种可提前1～2个世代，在植物育种上具有创新突破。作物抗逆性和产量显著提高。华南农业大学将“特籼占13”航天搭载，经地面选育，从SP4代中选育出早晚季适用的新品系“华航一号”较原种增产5%～15%，一般增产10%，同时得到5个品系，稻瘟病抗性比原“特籼占13”抗性频率从52.9%提高到70%以上[10-13]。改善农作物、蔬菜的品质。航天诱变后水稻蛋白质含量提高了8.7%～12%，青椒的Vc含量提高了19%～23%[11]。较转基因作物安全。航天诱变产生的变异属于内源基因发生改变，没有外源基因的加入，一般不存在基因安全性问题[3]。

1.4航天诱变育种国内外研究进展 我国是世界上掌握了返回式卫星技术的3个国家(俄、美、中)之一，在开展航天诱变育种研究方面具有得天独厚的优势，航天育种在我国自1987年开始尝试性研究，目前已在国内形成快速发展的趋势。至今，已通过国家或省级鉴定的小麦(Triticumaestivum)、水稻(Oryzasativa)、辣椒(Capsicumspp.)、番茄(Lycopersiconesculentum)等农作物及蔬菜品种72个，我国的航天育种已走在了世界前列。相比农作物，牧草的航天育种尚处于初始阶段，主要集中于紫花苜蓿品种的选育。航天育种小麦产量6 185.7 kg·hm-2，比普通小麦(4 698 kg·hm-2)提高了31%，航天育种大豆(Glycinemax)产量3 000 kg·hm-2，比普通大豆1 737 kg·hm-2提高了72%。

国外的航天育种以俄罗斯和美国为主，研究始于20世纪五六十年代，近年来，除了通过返回式卫星进行搭载试验外，主要在已建成的空间站进行了生物试验，如俄罗斯农业科学院和宇航局在“和平号”宇航站的太空温室里试种太空小麦获得成功；美国就植物对引力的感应进行研究，最终开发适合太空生长的植物，供宇航员食用[14-18]。国外在空间生物细胞学研究方面主要对经过空间诱变的哺乳动物细胞进行分子生物学及生理学研究，来了解空间环境对生物有机体的作用和影响，进一步研究空间生物细胞学的发展规律[19]。蔬菜航天育种方面，美国从20世纪80年代开始将番茄种子送上太空，在地面试验中得到了变异植株[20]。国外通过航天诱变育种已先后成功培育了多个农作物新品种应用于生产，但航天诱变在紫花苜蓿方面的研究国外相关报道很少。

2 紫花苜蓿航天诱变研究

2.1紫花苜蓿及其他草品种航天搭载 以往航天育种的注意力主要放在农作物和蔬菜上，忽视了草类植物，近几年开始探讨草类航天育种工作，且主要集中在紫花苜蓿研究。1987-2005年是我国航天育种的研究和立项阶段，在这期间先后利用返回式卫星和神舟飞船共进行19次搭载试验，搭载品种2 000余种，2006年开始进入发展阶段，2006年9月9日“实践八号”农业育种卫星一次搭载品种2 000多种，其中农作物约占40%，蔬菜约占30% ，而草品种仅占1%左右[4]，部分草类植物搭载品种见表1。另外，张蕴薇[21]指出，在草类植物航天诱变育种方面，1994年首次搭载了红豆草(Onobrychisviciaefolia)、紫花苜蓿、新麦草(Psathyrostachysjuncea)3种牧草，此后，神舟3号、4号、5号和实践八号，先后搭载了紫花苜蓿、草地早熟禾(Poapretensis)、野牛草(Buchloedactyloides)和白三叶(Trifoliumrepens)等，中国林业科学院花卉研发中心近年来对航天搭载的草地早熟禾(Poapretensis)、黑麦草(Loliumperenne)生长低矮的性状进行了研究。

2.2紫花苜蓿航天诱变研究

2.2.1诱变效应田间观测 紫花苜蓿种子航天搭载后，表现出较强的诱变效应。张月学等[8]研究发现，航天诱变的同一批紫花苜蓿不同品种，在发芽率、单株分枝数等性状上存在差异。任卫波[23-24]研究了搭载于第18颗返回式卫星的中苜1号、龙牧803、敖汉苜蓿3个品种，结果表明，中苜1号苗期搭载单株株高显著低于地面对照，而分枝期-开花期单株株高比地面对照显著增加；龙牧803搭载单株苗期和分枝期的株高相比地面对照显著增加，初花期则无显著差异；敖汉苜蓿搭载单株在3个时期的株高都显著高于地面对照，可见生物学效应因品种和时期而异，3个品种的诱变效率存在差异。王蜜等[25]研究搭载于“实践八号”的3个紫花苜蓿品系，发现紫花苜蓿搭载SP1代和SP2代种子的发芽率和盐胁迫发芽率均无显著变化；通过田间观测和数据分析发现，搭载后的紫花苜蓿SP1代单株株高、分枝数、单株生物量鲜质量、干质量均出现不同程度的增加，与地面对照差异均达到显著水平(P<0.05)；SP2代种子的千粒重增加了5%～9%，发芽率、种苗苗质量、芽长和根长显著增加，硬实种子数、霉变种子数显著减少。中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所与甘肃省航天育种中心及天水市农业科学研究所合作，以2002年搭载于“神舟3号”飞船的4个紫花苜蓿品种德宝、德福、阿尔冈金、三得利为基础材料，在兰州和天水建立了两个紫花苜蓿航天搭载材料选育圃及两个紫花苜蓿航天诱变育种试验区，连续3年观测记载，初步确定了7种变异类型：多叶(3株)、白花(1株)、速生和高产(14株)、大叶(11株)、抗蓟马、蚜虫(7株)、早熟(7株)、矮生、分蘖性强(2株)，所选单株已分别挂牌标记，正在进一步选育，其中多叶型紫花苜蓿新品系“兰航1号”已进入品比试验阶段。

表1 牧草航天搭载试验Tab 1 Test of forage space mutation

2.2.2诱变效应分子标记研究 分子标记(Molecular Markers)是近年出现的新型遗传标记，已经广泛应用于植物遗传图谱的构建、植物育种的早期筛选、植物遗传多样性分析与种质鉴定等方面。植物种子经航天诱变后，在地面种植而成的植株，所产生的变异，有的可以稳定遗传给下一代，有的不能稳定遗传给下一代。分子标记有利于变异植株的早期选择，同时一些早期选择表现不明显，而在后代中表现优良的植株，可以通过分子标记达到直接选择的目的。因此，分子标记技术越来越广泛的应用于植物航天诱变育种中[26-38]。

分子标记在紫花苜蓿航天育种中的应用，范润钧等[39-40]就搭载于“神舟3号”飞船的4个紫花苜蓿品种，从17对SSR引物中最终筛选出6对扩增条带较多、条带清晰、信号强的引物，对224株SP1代单株材料利用这6对SSR引物进行扩增，共检测到25个等位基因，其中15个与地面对照基因组存在多态性，多态性表现为扩增片段的缺失或增加。王蜜等[25]研究中国农业科学院草原研究所搭载于“实践8号”卫星的3个紫花苜蓿品系，在田间初步筛选出15个变异单株，随后对选择的单株材料开展了蛋白质与分子方面的检测分析，结果表明，搭载SP1代幼苗的过氧化物酶平均活性比地面对照提高了18.6%；聚丙酸胺凝胶电泳结果显示，过氧化物同工酶比对照增加了1条酶带；RAPD检测结果表明，15个变异单株通过株系自交鉴定，其中5个单株的株高变异可以稳定遗传，搭载SP1代的可遗传变异率为1.196。杜连莹等[41]用36对引物对8个搭载于“实践八号”的紫花苜蓿品种及地面对照进行RAPD随机扩增，通过筛选得到21个引物分别在8个品种扩增出带型清晰、重复性好和多态性高的条带，包括条带的新增和缺失；航天搭载的8个紫花苜蓿品种其中新增条带多态率最高的达9.72%；而缺失条带多态率最高为12.82%。

2.2.3诱变效应生理生化研究 任卫波等[7]研究搭载于“实践八号”的3个紫花苜蓿品系，发现诱变SP1代幼苗根尖细胞分离指数、染色体畸变等方面表现出较强的诱变效应，搭载后促进品系二、品系四的细胞正常有丝分裂，抑制品系一的细胞正常有丝分裂；搭载种子根尖细胞染色体出现了微核、染色体桥、断片、落后等畸变类型。冯鹏等[42]研究发现，种子含水量对诱变效应具显著影响，以含水量13%～15%为最佳。杜连莹等[41]对“实践八号”搭载的8个紫花苜蓿品种研究表明，SP1代根尖细胞的有丝分裂指数呈上升趋势；搭载后的8个品种叶片内POD活性均增强、可溶性蛋白含量均增高、叶片内SOD活性均降低。马学敏等[43]对不同含水量紫花苜蓿种子航天搭载后植株叶片保护酶活性的研究，得出空间诱变对植株的抗逆性产生正效应，并在含水量13%～15%时达到最大的诱变效应。

3 讨论与展望

航天育种是近20多年来发展起来的一项新兴育种技术，其综合了航天科技、空间辐射、分子生物学、遗传、育种等跨学科的高新技术，已成为空间生命科学研究的重要内容之一。航天诱变在地面无法模拟，具有其特殊性和优越性，已成为一种主要的诱变育种方法。目前航天诱变育种的研究大多数只是在田间对变异材料的直接选择，对引起变异的机理如细胞学、分子生物学及生物化学等方面还处于研究阶段，理论研究滞后于应用研究。另外，我国从事该项研究的人员十分分散，工作持续性不足，缺乏信息共享和材料交流，研究论文少，深入研究更少。

航天诱变育种多年研究得出其最显著的特点是提高植物生物量、早熟性和抗逆性，这对紫花苜蓿而言最为重要。在理论和机理研究的基础上，更应该加强育种方面的研究。通过田间观测、室内分析、分子标记等各种方法的综合评价，选出有益变异材料进行品种选育工作，由于诱变育种研究存在一定的不稳定性，如紫花苜蓿在SP1代选择的有益单株材料，SP2代种植后会出现个体分离，要继续选择，不能认为不稳定而放弃，通常到SP3代或SP4代就可基本稳定。

植物航天诱变具有不确定性。第一，可以创造出符合育种目标或期望的有益变异，经过多代选育可以培育出有益的新品种、新材料；第二，搭载不产生变异；第三，搭载后产生不利的变异。通常认为诱变SP1代植株发生变异，有些属于生理损伤，不能稳定遗传，有些可以稳定遗传给后代，再经过三或四代的选育，使得变异性状稳定遗传，获得表型和基因型变异均稳定的变异株系。

分子标记在紫花苜蓿航天诱变研究中的应用，有利于变异植株的早期选择，如一些早期田间选择表现不明显，而在后代却表现优良的植株，可以通过分子标记达到直接选择的目的，可用于分析诱变材料当代及后代基因型差异，鉴定变异群体中具有目标基因的个体。同时，利用分子生物学的方法克隆出引起变异的诱导基因，通过转基因技术将其转入到载体中，使目标性状得以表达，可以得到更多的育种材料。

[1] 杨红善,常根柱,周学辉,等.美国引进苜蓿品种半湿润区栽培试验[J].草业学报,2010,19(1):121-127.

[2] 杨红善,常根柱,周学辉,等.苜蓿引进品种半干旱、半湿润区适应性试验[J].西北农业学报,2011,20(1):86-90.

[3] 刘纪元.中国航天诱变育种[M].北京:中国宇航出版社,2007.

[4] Xu Y Y,Jia F,Wang B,etal.Changes in isoenzymes and amino acids in forage and germination of the first post-flight germination of seeds of three legume species after space-flight[J].Grass and Forage Science,1999,54:371-375.

[5] Mengoni A,Ruggini C,Vendramin G G,etal.Chloroplast microsatellite variations in tetraploid alfalfa[J].Plant Breeding,2000,119:509-512.

[6] Mengoni A,Gori A,Bazzicalupo M.Use of RAPD and microsatellite (SSR) variation to assess genetic relationships among populations of tetraploid alfalfa,Medicagosativa[J].Plant Breeding,2001,119:311-317.

[7] 任卫波,徐柱,陈立波,等.紫花苜蓿种子微卫星搭载后其根尖细胞的生物学效应[J].核农学报,2008,22(5):566-568.

[8] 张月学,刘杰琳,韩微波,等.空间环境对紫花苜蓿的生物学效应[J].核农学报,2009,23(2):266-269.

[9] Ourania I,Piergiorgio S,Enrico B,etal.Achievements and prospects in breeding for rhizomania resistance in sugar beet[J].Field Crops Research,2011,122:165-172.

[10] 王慧,陈志强,张建国，等.航天育种优良水稻品种华航一号[J].中国稻米,2003(6):18.

[11] 李源祥,蒋兴村,李金围，等.水稻空间诱变性状变异及育种研究[J].江西农业学报,2000,12(2):17-23.

[12] 陈忠正,刘向东,陈志强，等.水稻空间诱变雄性不育新种质的细胞学研究[J]．中国水稻科学，2002,16(3):199-205．

[13] 邢金鹏,陈受宜，朱立煌，等.水稻种子经卫星搭载后大粒型突变系分子生物学分析[J].航天医学与医学工程,1995(2):75-80.

[14] 密士军,郝再彬.航天育种研究的新进展[J].黑龙江农业科学,2002(4):31-33.

[15] 杨震,庞伯良,谭林.我国空间诱变育种研究进展[J].湖南农业科学,2006(6):19-21.

[16] 张蕴薇,韩建国,任卫波.植物空间诱变育种及其在牧草上的应用[J].草业科学,2005,22(10):59-63.

[17] 李培夫.航天诱变育种技术在作物育种上的应用[J].种子科技,2006,25(1):35-36

[18] 胡化广,刘建秀,郭海,等.我国植物空间诱变育种及其在草类植物育种中的应用[J].草业学报,2006，15(1):15-21.

[19] 蔡哲,张岚,舒峻,等.空间环境对细胞生物学特性的影响[A].2011航天工程育种论坛论文集[C].北京：中国空间研究院，2011:66-71.

[20] 扈新民,李亚利,高彦辉.航天诱变及其在辣椒育种中的应用及展望[A].2011航天工程育种论坛论文集[C].北京：中国空间研究院，2011:132-137.[21] 张蕴薇.草空间诱变育种研究进展[A].中国草学会牧草育种专业委员会2007年学术研讨会论文集[C].厦门:中国草学会,2007:443-445.

[22] 任卫波,韩建国,张蕴薇,等.几种牧草种子空间诱变效应的研究[J].草业科学，2006,23(3):72-76.

[23] 任卫波,韩建国,张蕴薇,等.航天育种研究进展及其在草上的应用前景[J].中国草地学报，2006,28(5):91-97.

[24] 任卫波,王蜜,陈立波,等.卫星搭载对苜蓿种子PEG胁迫萌发及生长的影响[J].草地学报,2008,16(4):428-430.

[25] 王蜜.紫花苜蓿种子空间诱变变异效应的研究[D].呼和浩特：内蒙古农业大学,2010.

[26] 周延清.DNA分子标记技术在植物研究中的应用[M].北京:化学工业出版社,2005:6-9.

[27] 黄艳霞,白昌军.分子标记技术及其在牧草中的应用[J].热带农业科学,2008,8(4):81-85.

[28] 余红兵,周峰,姚鹃，等.高空气球搭载诱导水稻育性降低突变体RAPD分析[J].韶关学院学报(自然科学版),2004,25(6):89-91.

[29] 桂枝,高建明.我国苜蓿育种的研究进展[J].天津农学院学报,2003,10(1):37-41.

[30] 杨青川,刘志鹏,呼天明，等.DNA分子标记技术在苜蓿研究中的应用[J].中国农业科技导报,2004,6(2):30-34.

[31] 刘志鹏,杨青川,呼天明,等.用SSR标记研究不同耐盐特性四倍体紫花苜蓿的遗传多样性[J].作物学报,2006,32(4):630-632.

[32] 张丽芳,魏臻武,杨占花,等.蒺藜苜蓿SSR反应体系优化及在一年生苜蓿种质鉴定中的应用[J].草地学报,2007,15(5):429-436.

[33] 魏臻武,符昕,耿小丽,等.苜蓿遗传多样性和亲缘关系的SSR和ISSR分析[J].草地学报,2007,15(2):118-123.

[34] 魏臻武,盖钧镒.豆科模式植物蒺藜苜蓿基因组研究进展[J].中国草地学报,2006(6):83-90.

[35] 耿小丽，魏臻武,姚喜红，等.采用流式细胞仪鉴定紫花苜蓿花药愈伤组织的变异[J].草业学报,2011,20(3):156-161.

[36] 屠德鹏,魏臻武,武自念，等.蒺藜苜蓿EST-SSRs分布特征及标记的开发[J].草业科学,2011,28(5):746-752.

[37] 江腾,林勇祥,刘雪，等.苜蓿全基因组WRKY转录因子基因的分析[J].草业学报,2011,20(3):211-218.

[38] 王蜜,魏建民,郭慧琴，等.紫花苜蓿空间诱变突变体筛选及其RAPD多态性分析(简报)[J].草地学报,2009,17(6):841-844.

[39] 范润钧,邓波,陈本建,等.航天搭载紫花苜蓿连续后代变异株系选育[J].山西农业科学,2010,38(5):7-9.

[40] 范润钧.空间搭载紫花苜蓿种子第一代枝株(SP1)表型变异及基因多态性分析[D].兰州:甘肃农业大学,2010.

[41] 杜连莹.实践八号搭载8个苜蓿品种生物学效应研究[D].哈尔滨：哈尔滨师范大学,2010.

[42] 冯鹏,刘荣堂,历为宏,等.紫花苜蓿种子含水量对微卫星搭载诱变效应的影响[J].草地学报,2008,16(6):605-608.

[43] 马学敏,张治安,邓波,等.不同含水量紫花苜蓿种子卫星搭载后植株叶片保护酶活性的研究[J].草业科学,2011,28(5):783-787.