GPD1-L基因检测及其与青壮年猝死综合征的相关性

徐小龙，王雯，刘超，侯一丁，黄雷，刘长晖，李越，成建定

（1.深圳市公安局坪山分局，广东深圳 518118；2.深圳市公安局罗湖分局，深圳罗湖 518004；3.广州市刑事科学技术研究所，广东广州 510030；4.中山大学中山医学院法医学系，广东广州 510080）

GPD1-L基因检测及其与青壮年猝死综合征的相关性

徐小龙1，王雯2，刘超3，侯一丁4，黄雷4，刘长晖3，李越3，成建定4

（1.深圳市公安局坪山分局，广东深圳 518118；2.深圳市公安局罗湖分局，深圳罗湖 518004；3.广州市刑事科学技术研究所，广东广州 510030；4.中山大学中山医学院法医学系，广东广州 510080）

目的探寻甘油-3-磷酸脱氢酶样基因（glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1 like gene，GPD1-L）的变异位点，讨论其与青壮年猝死综合征（sudden manhood death syndrome，SMDS）的关系。方法提取SMDS组及健康对照组血样的基因组DNA，采用PCR法扩增GPD1-L基因编码区外显子、外显子-内含子交界区以及3′侧翼区序列，直接进行DNA测序以明确遗传变异类型，并进行基因型频率和等位基因频率的统计学分析。结果在SMDS组中共检测到2个变异位点，c.465C＞T和c.*18G＞T，后者在SMDS组和对照组中基因型分布和等位基因频率存在一定差异，但无统计学意义（P＞0.05）。结论GPD1-L基因变异与中国人SMDS发生的相关性尚有待进一步研究。

法医遗传学；青壮年猝死综合征；甘油-3-磷酸脱氢酶样基因

青壮年猝死综合征（sudden manhood death syndrome，SMDS）是一种迄今为止原因未明，主要好发于泰国、老挝、柬埔寨、日本、中国等东南亚国家的猝死病症。在部分地区的青壮年死因中仅次于交通事故的第二大死因。随着分子遗传学的发展，对基因突变及单核苷酸多态性（SNP）在解释复杂多基因疾病的致病原因及发病机制的认识逐渐深入，有学者[1-4]发现，部分SMDS与编码人心脏电压门腔钠离子通道α亚基（Nav1.5）的SCN5A基因的结构异常密切相关。人心脏钠离子通道可以看作是由形成孔道的α亚基（Nav1.5）、调节性β亚基及其他相关作用蛋白一起构成的多蛋白复合体（multi-protein complex），对心脏钠离子通道的功能有重要调节作用，其基因结构异常也可引起心脏钠离子通道功能缺陷相关的疾病[5-6]。

London等[7]的研究显示，编码甘油-3-磷酸脱氢酶样基因（glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1 like gene，GPD1-L）的基因错义突变可导致钠通道向心肌细胞膜表面的转运受限，钠离子内流减少，引起Brugada综合征。前期研究[8-10]发现，SMDS在临床表型、猝死诱因、SCN5A分子遗传学方面与以Brugada综合征为主要代表的心脏钠离子通道疾病高度相似，故本研究假设GPD1-L基因突变有可能通过影响Nav1.5的表达和功能，从而与部分SMDS发生相关。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 SMDS组

收集2005年2月—2012年3月猝死于广东省广州、东莞、深圳、佛山、珠海等地区的男性散发个体SMDS病例血纱样本123例，籍贯主要为广东、湖南、江西、四川、福建等地区。

SMDS组入选标准：（1）生前身体健康，发育营养良好；（2）青壮年（17～45岁）；（3）死于夜间睡眠中，以凌晨2～4时为多见，偶见于午睡中猝死；（4）死因鉴定未查见足以解释死因的病理学变化。

排除标准：（1）排除物理、化学、生物及机械等暴力因素致死的病例；（2）排除有明确死因或生前患有冠状动脉粥样硬化性心脏病、心肌炎、心肌病等器质性心脏疾病及高血压、糖尿病、其他代谢性疾病病例；（3）死因可疑病例。

1.1.2 对照组

收集2005年2月—2012年3月在中山大学法医鉴定中心做亲子鉴定的男性无关个体（20～49岁）血纱样本102例，籍贯主要为广东、广西、江西、福建、湖南等地区，无心血管疾病史及晕厥史，体格检查正常。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取

使用磁性DNA半定量提取试剂盒（长春博坤生物科技有限公司）从白细胞中抽提DNA，剪取3mm× 3mm大小血纱于96孔提取板中（1mL深孔板），并按操作说明放置在DNA自动化提取工作站（烟台澳斯邦公司）相应位置，启动程序，约2.5h后程序运行结束，模板DNA自动收集至U型板中，4℃保存备用。少部分陈旧、血迹较淡的样本在Maxwell 16核酸自动纯化仪（美国Promega公司）上经DNA IQ试剂盒（美国Promega公司）纯化。

1.2.2 扩增DNA目的片段

根据Genebank已知人类GPD1-L基因序列（NCBI ID：NM_015141.3），合成引物序列（表1）。扩增SMDS 组GPD1-L基因编码区外显子、外显子-内含子交界区以及3′侧翼区序列，在9700型扩增仪（美国AB公司）上进行扩增。

PCR反应体系：GoTaq®Green Master Mix（2×）15 μL，正向引物1 μL（10 μmol/L），反向引物1 μL （10 μmol/L），DNA模板2 μL，加ddH2O 11 μL至总体积30 μL。

PCR反应条件：95℃2min；95℃30s，60℃40s，72℃50s，35个循环；72℃10min，4℃保存。

表1 PCR特异性引物

1.2.3电泳

PCR产物5 μL与参标DL2000 DNA Marker经琼脂糖凝胶电泳（100 V，30 min），溴化乙啶染色后在紫外灯下观察PCR产物的目的条带。

1.2.4 直接测序与结果比对

对所有PCR产物过膜纯化后进行测序，测序引物与PCR引物相同，所有可疑突变均经反向测序确定。纯化、测序过程由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。测序结果用ClustalX软件进行多序列比对，与Genebank人类GPD1-L标准序列（NCBI ID：NM_015141.3）对比，检测到的突变序列采用重复测序验证，以保证结果的准确性，分析突变所导致的氨基酸改变。

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0统计分析软件包，计算SMDS组与对照组的基因型频率和等位基因频率，并检验是否符合Hardy-Weinberg平衡，两组计数资料比较用χ2检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 SMDS组检测到的GPD1-L基因变异

对GPD1-L基因所有编码区外显子、外显子-内含子交界区以及3′侧翼区进行测序，发现2个遗传变异（图1～2）。c.465C＞T位于4号外显子，第155位氨基酸丙氨酸（Ala）没有发生改变，其在SMDS组中的检出率（变异个体数/检测总例数）仅为0.97%，在对照组中的检出率为0（表2）。c.*18G＞T位于3′侧翼区，不编码氨基酸，其在SMDS组中的检出率为12.5%，在对照组中的检出率为10.8%（表2）。

图1 GPD1-L基因变异位点c.465C＞T正向测序比对结果

图2 GPD1-L基因变异位点c.*18G＞T正向测序比对结果

2.2 GPD1-L基因c.*18G＞T与SMDS的相关性

在SMDS组和对照组中均发现GPD1-L基因存在c.*18G＞T，并以高频形式出现，经χ2检验，基因型在SMDS组和对照组中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05），比较组间基因型频率和等位基因频率的差异，无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表2 GPD1-L基因变异位点

表3 SMDS组与对照组GPD1-L基因多态位点c.*18G＞T的基因型频率和等位基因频率［例（%）］

3 讨论

人类GPD1-L基因可编码由351个氨基酸组成的蛋白质，其与GPD有84%的同源性。GPD是一种二聚体蛋白，参与磷酸甘油穿梭作用，将胞浆中NADH的电子转移给线粒体转运链，影响能量产生、渗透调节、肿瘤生长和凋亡[7，11]。2002年，Weiss等[11]在对Brugada综合征的研究中首次报道了GPD1-L这一候选基因，它定位于3号染色体上，与Ⅱ型Brugada综合征有关，随后研究证明这个基因在心肌细胞膜表面与SCN5A编码的Nav1.5共表达。

Van Norstrand等[12]在83例年龄为（14.6±10.7）岁突发性猝死综合征（sudden unexpected death syndrome，SUDS）病例以及随后的221例婴幼儿猝死综合征（sudden infant death syndrome，SIDS）病例中检测到GPD1-L基因的3个变异位点，分别是E83K、I124V和R273C，3个位点都呈高度保守状态，并且在300例对照组中未检出。在瞬时转染上述突变体的HEK细胞及新生大鼠心肌细胞中，均证实突变体可使钠电流密度下降。进一步机制研究表明，GPD1-L基因与SCN5A基因在细胞膜表面共表达，提示二者之间可能存在直接的相互作用；GPD1-L基因可能与离子通道有相互作用的蛋白质发生作用，如ankyrin-G、syntrophin、caveolin-3、Nedd4-2[13-14]；GPD1-L基因通过影响蛋白激酶A依赖的磷酸化作用，阻断内质网的信号[15-16]；GPD1-L基因影响氧化状态来调节心脏钠离子通道的功能[16-17]。

London等[7]在有16例典型病例及27例其他成员的Brugada综合征的大家系研究中发现，GPD1-L基因的变异位点A280V在300例对照组中未检出。过表达野生型GPD1-L使SCN5A基因在HEK细胞钠电流无明显改变，而过表达A280V GPD1-L却使钠电流下降了约48%，但A280V不影响激活期和失活期钠通道的动力学参数，也不改变失活、复活的进程，从失活期复活的时间常数也不受影响。与野生型GPD1-L相比，A280V使SCN5A基因在HEK293细胞膜表面的表达下降了48%，从而推测A280V可能是通过干扰细胞内GPD1-L基因的定位从而降低膜表面SCN5A基因的表达，导致钠电流的下降引起Brugada综合征。

Makiyama等[18]在80例Brugada综合征病例中检测到GPD1-L基因的1个同义突变c.465C＞T（p.A155A）及1个内含子变异c.48-30T＞C，这两个变异在220例对照组中均未发现，此外，发现1个SNP位点c.*21G＞T位于3′侧翼区，其在SMDS组和对照组中差异无统计学意义。

上述研究表明，GPD1-L基因对心肌钠通道具有重要的功能调节作用，是Brugada综合征、SIDS以及SMDS的重要易感基因。本研究以SMDS散发病例和健康对照人群作为研究对象，筛查GPD1-L基因的可能遗传变异，结果发现两个变异位点。其中，c.465C＞T （p.A155A）为同义多态，位于4号外显子，其参与编码的第155位氨基酸丙氨酸未改变，但本实验只检出1例且为杂合型，其在SMDS组中的检出率为0.97%，病理生理意义不明，有待进一步研究。然而，c.*18G＞T位于3′侧翼区，作为一个高频率SNP位点在SMDS组和对照组中广泛存在，进一步比较各组基因型频率和等位基因频率，发现其差异无统计学意义，但此类非编码区变异是否通过调控GPD1-L基因的表达而影响SMDS的易感性尚有待进一步阐明。

本研究从“心脏钠离子通道疾病是SMDS原发病因之一”这一假说出发，检测了中国人GPD1-L基因的变异情况。在本次所检测的中国人SMDS病例中未发现GPD1-L外显子的已报道的或新的非同义突变，故GPD1-L基因的结构与功能异常是否与中国人SMDS的易感性相关尚有待扩大样本量和功能研究后进行探索和验证。

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（本文编辑：黄平）

Gene Detection of GPD1-L and the Association with Sudden Unexplained Death Syndrome in Young Adults

XU Xiao-long1,WANG Wen2,LIU Chao3,HOU Yi-ding4,HUANG Lei4,LIU Chang-hui3,LI Yue3,CHENG Jian-ding4
（1.Pingshan Branch of Shenzhen Public Security Bureau,Shenzhen 518118,China;2.Luohu Branch of Shenzhen Public Security Bureau,Shenzhen 518004,China;3.Guangzhou Institute of Criminal Science and Technology,Guangzhou 510030,China;4.Department of Forensic Medicine,Zhongshan School of Medicine, Sun Yat-Sen University,Guangzhou 510080,China）

ObjectiveTo analyze the variations of glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1 like gene（GPD1-L）and address the association with sudden manhood death syndrome（SMDS）.MethodsThe genomic DNA was extracted from blood samples of the SMDS group and the normal control group.The exons,exon-intron boundaries and 3′-UTRs of coding region of GPD1-L were PCR amplified and DNA sequenced directly to confirm the types of variations.The genotype frequency and allele frequency were analyzed statistically.ResultsThere were two variants in the SMDS group,c.465C＞T and c.*18G＞T,the latter existed certain degree difference of genotype distribution and allele frequency between the SMDS group and the control group,but there was no statistically significant（P＞0.05）.ConclusionThe relation between gene mutation of GPD1-L and the occurrence of Chinese SMDS deserves a further research.

forensic genetics;sudden manhood death syndrome;glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1 like gene

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2013.05.008

1004-5619（2013）05-0348-05

国家自然科学基金面上项目（81172901）；中央高校基本科研业务费专项资金项目（11ykpy04）；“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAK02B02）

徐小龙（1977—），男，湖北黄冈人，主检法医师，主要从事法医病理学研究；E-mail：992081468@qq.com

成建定，男，教授，主任法医师，主要从事猝死的分子病理学及细胞电生理学研究；E-mail：chengjd@mail.sysu.edu.cn

2012-08-21）