采用诱导分化的SH-SY5Y 细胞建立酒精性痴呆体外研究模型的探讨

杨海玉，刘 勇

慢性酒精中毒对于人类健康的危害日趋严重。大脑是酒精诱导损伤的最常见靶器官之一，长期大量饮酒可引起脑器质性损害，并逐渐发展至痴呆状态，临床称之为酒精性痴呆(alcohol-associated dementia，AAD)［1］。由于其治疗手段有限且治疗效果不佳，大多数AAD 患者不能完全恢复至正常。酒精属亲脂性小分子化学物质，可迅速通过血脑屏障和细胞膜，对脑组织造成直接损害。目前研究发现，短暂酒精暴露即可产生严重的细胞毒性，引起神经元大量死亡;而长期酒精接触可显著抑制神经元、星形胶质细胞增殖及降低细胞存活率，导致神经元分化延缓以及结构破坏［2，3］。但是，关于这方面的分子机制还有待进一步深入研究。由于取材受到来源以及伦理学的限制，使用人原代培养神经细胞作为研究对象困难很大。SH-SY5Y 细胞又称为人神经母细胞瘤细胞，该细胞诱导分化后可表现神经元形态特征，目前常用于神经元损伤模型的研究［4，5］，具有取材培养方便、易行等优势。因此，在本研究中我们采用维甲酸(retinoic acid，RA)诱导SH-SY5Y 细胞分化，并通过给予不同浓度的酒精连续培养，观察酒精对SH-SY5Y 细胞的损伤作用，为进一步研究AAD 的发病机制提供简单可行的体外研究模型。

1 材料与方法

1.1 实验主要试剂

DMEM 高糖培养基、胰蛋白酶均购自美国Gibco 公司;胎牛血清购自美国Hyclone 公司;RA、四甲基偶氮唑蓝［3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT］、碘化丙啶(propidium iodide，PI)购自美国Sigma 公司。

1.2 SH-SY5Y 细胞培养与诱导分化［6］

SH-SY5Y 细胞购自中国科学院细胞库。细胞培养采用DMEM 高糖培养基加入体积分数为10%的胎牛血清，5%CO2、37℃条件培养细胞，待细胞长至80%～90%融合时，用体积分数为0.25%的胰蛋白酶消化传代。将细胞按1×104浓度平均接种到96 孔板，待细胞长至60%～70%融合时，换用含体积分数1%胎牛血清的培养基进行培养，并加入终浓度为10μm 的RA 诱导细胞分化，每天换液一次，连续6d，光学显微镜下观察细胞形态变化。

1.3 检测酒精对SH-SY5Y 细胞增殖的影响

本研究采用MTT 比色法检测酒精对SH-SY5Y细胞增殖的影响。该细胞诱导分化后，于7d 弃去含RA 的培养基，酒精组细胞分别加入含不同浓度酒精(10～400mol/L)的培养基，对照组细胞加入不含酒精的培养基，置培养箱中连续培养24h。之后，每孔加入20μl MTT 溶液(5mg/ml)，37 ℃培养4h。弃去所有溶液后加入200μl DMSO 溶液，振荡10min，采用酶标仪570nm 波长检测光密度(optical density，OD)值，并根据各组OD 值计算细胞存活率。

1.4 检测酒精对SH-SY5Y 细胞凋亡的影响

PI 是一种能穿过破损细胞膜且与DNA 结合的荧光染料，散发红色荧光，常用于细胞凋亡检测。酒精组细胞给予酒精(100mol/L)作用24h 后，弃去培养基，用PBS 洗3 次，然后每孔滴加适量PI 染色液覆盖细胞，避光染色10min，PBS 洗3 次后采用荧光显微镜(型号DM3000，德国徕卡公司)观察取图。对照组给予PBS 代替酒精，其余处理同酒精组。凋亡细胞的特征表现为细胞核呈明显固缩、浓染。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 SH-SY5Y 细胞诱导分化后的形态观察

如图1 所示，未分化的SH-SY5Y 细胞呈长梭形，贴壁生长良好(见图1A);而在使用RA 诱导分化后细胞胞体增大，有较多细长的突起，表现神经元形态特征(见图1B)。

2.2 酒精对SH-SY5Y 细胞增殖的影响

分化后的SH-SY5Y 细胞经不同浓度酒精作用24 h，采用MTT 法检测细胞增殖变化。实验结果显示，酒精浓度达到100 mol/L 时，与对照组相比，细胞增殖受到明显抑制(P＜0.05);并且随着酒精浓度的增加(100～400mol/L)，细胞增殖抑制呈浓度依赖关系(见图2)。

图1 SH-SY5Y 细胞形态观察结果

图2 MTT 法检测不同浓度酒精对SH-SY5Y 细胞增殖的作用

2.3 酒精对SH-SY5Y 细胞凋亡的影响

如图3 所示，酒精组(100mol/L)细胞凋亡现象明显，可见大量细胞表现胞核皱缩、浓染(PI 染色阳性)(见图3B)，而对照组则少见凋亡细胞存在(见图3A)。

图3 PI 染色检测酒精诱导SH-SY5Y 细胞凋亡结果

3 讨论

AAD 是慢性酒精中毒最为严重的精神病状态，也是长期大量饮酒引起脑器质性损害的结果，临床表现记忆力缺损伴其他认知功能障碍为其主要特征。研究结果显示慢性酒精中毒已成为诱导痴呆发病的重要因素，AAD 患者可占痴呆发病人群的21%～24%［7］。目前研究表明慢性酒精中毒导致的脑损害是一个慢性进展性过程，呈不可逆性并伴有多种病理学改变。研究证实慢性酒精中毒患者的特定脑区可出现选择性神经元或神经核团丢失、神经轴突减少以及复杂性突触结构退化等病理变化，其机制与慢性酒精作用促进氧化应激和神经炎性反应、抑制神经营养因子和粘附分子表达、破坏神经胶质细胞及其功能、影响神经递质释放以及干扰细胞内信号传导等密切相关［8～10］。目前有关酒精与痴呆发生的关系及其具体分子机制仍不十分清楚，因此建立简便易行的酒精性痴呆体外研究模型将有助于深入探讨这类疾病的发病机制。

SH-SY5Y 细胞具有神经元分化潜能，是目前公认用于神经系统疾病研究的细胞模型。本课题以SH-SY5Y 细胞为实验对象，以RA 为诱导剂，通过诱导细胞分化，进一步观察酒精对该细胞的损伤作用。MTT 检测证实酒精对SH-SY5Y 细胞增殖具有明显的抑制作用，并且呈浓度依赖性。另外通过PI 染色法进一步观察证实，酒精可诱导SH-SY5Y 细胞发生显著凋亡。以上结果提示SH-SY5Y 细胞对酒精诱导损伤敏感，可用于建立研究AAD 发病机制的体外模型。

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