SPR 生化分析仪及其在样品检测中的应用＊

符运良，林 红

（海南师范大学 物理与电子工程学院，海南 海口 571158）

引 言

基于表面等离子共振（surface plasmon resonance，SPR）原理的生物传感技术是一种先进的光学生物化学检测技术，近几年来，该生物化学传感检测技术在监测生物分子之间的结合反应方面有着广泛的应用［1］，该传感检测技术与传统的生化分析方法（如液相色谱等）相比，具有检测时间少、检测样品无需任何标记、检测结果准确、检测灵敏度高等优点，并且还能够实现在线、实时连续检测。目前，基于表面等离子共振检测技术还在生物科技、药物筛选、环境检测、食品检测等多个领域，成为最具发展潜力的生化检测方法之一［2－5］。国内已有多家单位设计、研制基于SPR 的生化传感器，而可靠性能高、便携式SPR 生化传感器［6－7］，是SPR 生化分析仪发展的方向。以河南农业大学迅捷公司生产的HPSPR－6000生化分析仪为例，对仪器的工作原理、技术参数等方面进行介绍，同时介绍其在磺胺二甲嘧啶抗原与抗体结合反应检测中的应用结果。

1 SPR原理

SPR 原理如图1所示，光源发出的单色光，经过TM 波偏振器（图中未标）产生的偏振光经过耦合棱镜，照射到金膜表面上，金膜表面另一侧流有被测样品（液体、气体等），反射光信号由线阵列CCD 检测。由于光照射，在金膜表面将产生表面等离子波，当表面等离子波与入射光波在平行表面分量相等时，发生等离子谐振，导致反射光强减少，导致CCD 检测器接收到的光强度急剧下降，形成一条黑线，则为SPR 共振峰，被检信号可通过数模转换后由计算机显示输出。

对于生物分子的识别检测或分子之间的动态反应程度检测，首先在芯片表面固定一层生物分子识别膜，如果样品中有能够与芯片表面的生物分子识别膜相互作用的分子，由于结合反应，就会引起表面物质折射率变化，从而导致反射光强变化。通过实时监测SPR 传感器反射光强变化过程，可获得生物分子动态结合或解离过程，可以获得被分析物的浓度、亲和力、动力学常数和特异性等信息［8］。HPSPR－6000生物分析仪采用Kretschmann结构构建高精度光学传感系统，光源为LED 光源，波长为850nm，并把上述光源、TM 偏振器、棱镜、信号检测转换等器件集成在一个黑色盒子里（如图2所示），以消除外界杂散光对检测信号的影响。

图1 SPR 传感器原理图Fig.1 Schematic of SPR sensor

图2 SPR 传感器集成器件Fig.2 Integrated component of SPR sensor

图3 SPR 传感器结构图Fig.3 Schematic illustration of SPR sensor

2 技术参数

HPSPR－6000生化分析仪由液体动力系统、进样系统、模式选择系统和检测系统4部分组成，其结构如图3所示。

2.1 动力系统

HPSPR－6000生化分析仪的动力系统的动力源为蠕动泵，蠕动泵的工作控制面板如图4所示，通过触摸按键，实现蠕动泵右转和左转的功能选择，以及转速的选择，转速以数字方式显示在控制面版上。另外，还可实现蠕动泵暂停和加速，使用非常方便。它的作用是为三个样品流通通道的样品流动提供动力，当生物分子样品流经检测芯片表面时，进而研究分子间的相互作用或溶液的浓度。样品流动系统是一种高精密的进样控制系统，样品流速可控制在0.006～29mL／min。

图4 蠕动泵工作控制面板Fig.4 Control panel of peristaltic pump

图5 功能选择菜单Fig.5 Menu of function selection

2.2 样品处理系统

样品处理系统的主要功能是将被测液体样品注入到流通池中，HPSPR－6000生化分析仪采用内置样品架，连接三条微型软管，构成三通道进样系统。当蠕动泵工作时，通过微型软管，将液体样品注入到流通池中，采用自动进样工作方式，仪器具有自动化、智能化。另外，将分析测试后的液体样品，也通过微型软管回收到废液瓶中。

2.3 工作通道选择

HPSPR－6000生化分析仪有三个工作通道，通过功能菜单选择其中某个通道为工作通道，使液体样品在该通道中流动及检测。另外，为了消除背景噪声对检测结果的影响，也可以选两个通道，其中一个通道内流通被测液体样品，作为信息通道，另外一个通道流通基质样品，作为参考通道，信息通道响应扣除参考通道响应，即可得到精确的液体样品结合反应响应。

2.4 检测系统

检测系统是HPSPR－6000生化分析仪的主要核心，检测芯片是在玻璃基片上镀一层50nm 厚的金膜，形成裸金片，根据实验要求，在裸金片表面可固定羧甲基化、氨基端等不同功能分子层。HPSPR－6000生化分析仪将芯片固定在集成盒子边上，然后将芯片连接在检测元件上，检测的样品折射率范围为1.30～1.36。

2.5 检测和分析软件

HPSPR－6000生化分析仪配套软件分为在线检测软件和分析软件，对于在线检测软件，可通过菜单进行选择实现某个功能，如图5所示。如选择、传感器、通讯和测试菜单，选择菜单下又有通道、曲线、分析方法、累加次数等子菜单功能，通道子菜单可以选择检测通道，等等。另外，将检测到的样品信号同步呈现在LCD 界面上，形成直观的检测SPR 曲线。分析软件对检测软件生成的数据进行数据传送保存，并对生物分子之间进行动力学和相关性分析，计算出不同生物分子之间的结合和解离常数。

3 SPR生化分析仪在药物残留检测中的应用

免疫特异性结合反应检测是表面等离子共振传感器应用最多的检测手段之一［9－10］，用HPSPR－6000生化分析仪检测了磺胺二甲嘧啶抗体与其衍生物的特异性结合，方法步骤为：首先在芯片表面自组装一层单分子膜磺胺二甲嘧啶－BSA，SPR 生化分析仪传感响应曲线如图6所示。（1）传感器初始化后，点击“标定”，出现SPR 曲线，曲线稳定后，向芯片表面流动注入1mol／L的11－巯基十一烷酸，时间约2h，待信号稳定后，用PBS缓冲液冲洗，从而使芯片表面羧基化；（2）将0.4mol／L EDC和0.1mol／L NHS（1∶1，体积比）混合后，注入芯片表面，流速为10μL／min，活化芯片表面的羟基，形成活性酯，SPR 信号上升，如图6中的1所示。用PBS 缓冲液注入冲洗表面，SPR 信号下降；（3）将磺胺二甲嘧啶－BSA 用醋酸缓冲液（pH＝4.4）1∶50倍稀释，以10μL／min流速注入芯片中，结合信号上升，如图6中的2所示，用PBS缓冲液冲洗，这样抗原便固定在芯片表面上；（4）将1mol／L 乙醇胺（pH＝8.5）以10μL／min的流速注入，灭活封闭芯片表面上末被蛋白结合的活性位点，如图6中的3所示，以PBS缓冲液冲洗，信号强度回到基线，如图6中的4所示，这样完成分子识别膜的制备。

抗体浓度以PBS缓冲液稀释100倍，与磺胺二甲嘧啶样品（浓度4.5ng／mL）混合，以10μL／min 流速注入芯片表面，芯片表面抗原与抗体发生抑制免疫结合反应，SPR 信号上升，如图6中的5所示，放大曲线如图7所示，基线响应值为23 600IU（intensity unit），样品流入表面，响应值为24 730IU，结合响应值为1 130IU。从图7，当被测样品浓度较低时，在反应起始的一段时间内，相对响应值与时间近似呈线性关系。

图6 芯片表面固定磺胺二甲嘧啶－BSAFig.6 Immobilization of SMT－BSA

图7 抗原与抗体的结合反应Fig.7 The inhibition response SPR curve

图8 磺胺二甲嘧啶连续检测响应曲线Fig.8 Sensorgram of continuous detection for sulfamethazine（SM2）

利用连续检测的方法对磺胺二嘧啶进行了检测。三个不同浓度磺胺二甲嘧啶与抗体混合后，依次流过芯片表面，两个混合物之间交替注入PBS缓冲液，所得到的连续检测曲线如图8所示，混合物中磺胺二甲嘧啶样品与抗体结合，剩余的抗体与芯片表面的抗原结合，SPR 响应曲线上升，当注入缓冲液后，抗体从芯片表面解离，但是由于解离的速度缓慢，对应于SPR 响应曲线平缓区。连续检测是基于一定浓度的抗体与固定在芯片表面的磺胺二甲嘧啶抗原结合所得相对响应值与时间近似呈线性关系，而且样品浓度在较小的一定范围内，样品浓度的连续检测，对于减少芯片的再生过程，减少检测时间具有重要的作用。

当样品中含有磺胺二甲嘧啶时，与磺胺二甲嘧啶抗体结合，则抑制抗体与芯片表面的抗原结合，导致结合值减少，SPR 信号响应下降，磺胺二甲嘧啶样品浓度越大，抑制抗体与芯片表面抗原的结合的能力越强，结合值就越少，检测到的SPR 信号响应越小。因此，通过竞争抑制反应的结合值与磺胺二甲嘧啶样品浓度之间的关系，便可得到浓度抑制的标准曲线，通过标准曲线，当检测到某浓度的结合响应值时，由标准曲线便可得到某磺胺二甲嘧啶样品的浓度。

4 结 论

以HPSPR－6000生化分析仪为例，介绍了其工作原理、技术参数、结构组成和各部分的功能，并用分析仪得到芯片表面生长磺胺二甲嘧啶—BSA 分子识别膜过程的SPR 响应信号，并用抗原与抗体之间的免疫特异性结合，检测了反应响应曲线。HPSPR－6000生化分析仪使用方便、操作简单、检测灵敏度高、结果准确，对于生化分子之间的动力反应过程研究是一种较好的仪器。

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