莲籽通心粉中莲心总碱的大孔树脂纯化工艺研究

莲籽通心粉中莲心总碱的大孔树脂纯化工艺研究

李露1，2，薛淑静1，2，周明1，2，何建军1，2，关健1，2，张凌霄3，杨德1，2，郭鹏1，2
（1.湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所，武汉，430064；2.湖北农业科技创新中心农产品加工与核农技术分中心；3.华中农业大学楚天学院）

选用乙醇二次回流法粗提莲籽通心粉中的莲心总碱，粗提物通过大孔树脂柱层析的吸附与洗脱进一步分离纯化。通过研究得出，D101大孔树脂较适宜进行莲心总碱的纯化，其最佳的吸附条件为:上样液浓度10.00 mg/mL、pH值9、体积30 mL（0.43 BV）、流速1 mL/min，此工艺得到最大吸附量为9.55 mg/g；其最佳的洗脱条件为:乙醇浓度70%、pH值2、体积4 BV、流速1.4 mL/min，洗脱率达89.93%，经纯化后最终得率为64.39%。

莲籽通心粉；莲心总碱；大孔树脂；纯化

莲籽是睡莲科水生草本植物莲的种子。我国莲籽资源丰富，除青海、西藏外，我国大部分地区均有出产[1]，近10 a来，莲籽生产的发展速度很快，仅湖北2006年莲籽产量就达到29 690 t（干品）。2011年湖北省莲籽总种植面积达到4万hm2。

莲籽的加工一般要经过干燥、分级、去壳、除皮去心等工序，莲籽心被直接扔掉，造成了资源的极大浪费和环境污染。因此开发利用莲籽副产品，对提高莲籽的经济效益、充分利用资源和保护环境都有着重要的实际意义[2]。

副产物莲籽通心粉的主要成分是莲籽心。莲籽心具有清心理气火、固精血之功效。莲籽心中主要 含 有 莲 心 碱 （Liensinine）、 异 莲 心 碱（Isoliensinine）、甲基莲心碱（Neferine）等生物碱，这3种同属双苄基异喹啉类生莲心碱系[3～5]。研究表明，莲心碱有降压、防治心律失常和心肌缺血的作用[6]，莲心碱具有很高的医疗价值和较强的抗氧化性能，已成为现代中医药研究的热点之一，临床应用前景广阔[7]。从莲籽通心粉中提取莲籽碱具有资源廉价丰富和环保的优点。本研究选用乙醇二次回流法粗提莲籽通心粉中的莲心总碱，通过考察上样液的浓度、体积、pH值以及优化洗脱液浓度、体积、pH值，确定了较佳的大孔树脂柱纯化莲心碱的工艺，为从莲籽加工副产物通心粉中提取莲心碱的工业化加工奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

莲籽通心粉由湖北省洪湖晨光实业有限公司提供；原料预处理，10目筛初筛，初筛物于55℃烘干，粉碎，过40目筛，待用。

1.2 试验方法

①莲心总碱的含量测定a.标准曲线的制备。准确称取甲基莲心碱标准品粉末5 mg，于5 mL容量瓶中，用0.1 mol/L盐酸溶解并定容至刻度、摇匀。分别吸取0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mL于10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L盐酸定容至刻度，然后分别于282 nm波长处测定吸光度。以0.1 mol/L盐酸为空白参比，以吸光度（A）为纵坐标，甲基莲心碱的溶度（C）为横坐标（C），绘制标准曲线（见图1）。

图1 甲基莲心碱标准曲线

b.莲心总碱含量的测定。准确称取粗提莲心碱冻干品黄色粉末0.1 g于100 mL容量瓶中，用0.1 mol/L盐酸溶解并定容、摇匀。各取定容液1 mL于10 mL量瓶，用0.1 mol/L盐酸溶解并定容至刻度、摇匀，备用。以0.1 mol/L盐酸为空白参比，于282 nm波长处测定吸收度，换算得到生物总碱浓度，再根据下式计算样品中莲心总碱的含量：

②莲心生物碱的提取 称取一定量预处理的原料，置于圆底烧瓶中，分2次进行乙醇回流提取，第一次用与原料质量比为10:1的90%乙醇，在60℃下回流提取60 min，抽滤收集提取液；再加入与第一次提取同样体积的90%乙醇溶液进行第二次提取，时间为45 min，将2次提取液合并储存，备用，即得莲心生物碱提取液[8]。将提取液旋转蒸发至无乙醇，移入分液漏斗，静置两昼夜分层分离。将分离物冷冻干燥为粗提莲心碱固体粉末，备用。

③大孔吸附树脂的选择 将0.1 g粗提莲心碱定容到100 mL，调节pH值为10；分别称取预处理过的大孔吸附树脂D101和AB-8各1 g，并置于100 mL锥形瓶中，再加入上述溶液20 mL，在室温下静置24 h，取下清液测定其中总生物碱含量，计算各树脂的静态吸附量。通过比较2种树脂的比吸附量，选择合适的树脂。

④树脂吸附条件优化试验a.上样液浓度对吸附效果的影响。称取经预处理的D101干树脂22 g，湿法装柱，将粗提莲心碱冻干品配成浓度2.5、4.5、5.5、7.5、10.0、12.5 mg/mL的上样液。取pH值为10的上样液体积30 mL（0.425 BV），用恒流泵以1 mL/min流速上柱从树脂上方流下，收集流出液；静置2 h，使用超纯水水洗除杂至紫外检测仪数显值在A≤0.080，并收集水洗液。用紫外可见分光光度计在282 nm处测定吸光度，根据公式（2）得到D101吸附树脂对莲心总碱的比吸附量。

b.上样液的体积对吸附效果的影响。称取经预处理的D101干树脂22 g，湿法装柱。上样液的浓度选取1.2④a中最佳浓度，按10、20、30、40、50、60、70 mL的梯度体积，逐次将10 mL上样液加入层吸柱，以1 mL/min流速从树脂上方流下，同时以每10 mL收集流出液，同1.2①b的方法计算得到D101吸附树脂的上样流出液中莲心总碱含量，确定动态吸附上样体积的泄漏点。

c.上样液pH值对吸附效果的影响。称取经预处理的D101干树脂22 g，湿法装柱，将上样液pH值调节为8、9、10、11、12，上样液的浓度和体积值选取1.2④a和1.2④b中的最优值，体积30 mL，以1 mL/min流速上样，收集流出液；静置2 h，使用超纯水水洗除杂至紫外检测仪数显值在A≤0.080，并收集水洗液。同1.2④a的方法计算得到D101吸附树脂的比吸附量。

⑤树脂洗脱优化试验a.洗脱剂浓度对洗脱效果的影响。称取经预处理的D101干树脂22 g，湿法装柱。上样液依据1.2④得出最佳条件进行，收集流出液和水洗液，用紫外可见分光光度计在282 nm处测定吸光度，计算得到D101吸附树脂对莲心总碱的吸附量。然后分别将0、10%、15%、30%、70%、90%的乙醇溶液，在pH值3、体积2.5 BV（175 mL）、流速为1.4 mL/min条件下进行洗脱，收集洗脱液，并用紫外可见分光光度计在282 nm处测定吸光度，根据公式（3）计算得到D101大孔树脂洗脱率。洗脱剂洗脱率的计算公式为：

b.洗脱剂用量对洗脱效果的影响。前期处理同1.2⑤a。设定洗脱液体积为1、2、3、4、5、6 BV，流速为1.4 mL/min，以1.2⑤a得出的最佳乙醇浓度，pH值3对树脂进行洗脱，收集洗脱液，同1.2⑤a方法计算得到洗脱率。

c.洗脱剂pH值对洗脱效果的影响。前期处理同1.2⑤a。调制洗脱剂pH值为1、2、3、4、5的乙醇溶液，按1.2⑤a和1.2⑤b得出的最佳乙醇浓度、体积，在流速为1.4 mL/min条件下进行洗脱，收集洗脱液，同1.2⑤a方法计算得到洗脱率。

⑥最终提取率的计算 莲心总碱最终得率是指莲心总碱提取液经过树脂吸附与洗脱后得到的含量与未吸附与洗脱之前莲心总碱含量的比值，计算公式为：

1.3 数值分析

本试验中数据分析采用Excel 2007。

2 结果与分析

2.1 粗提莲心总碱含量的测定

取25 g莲籽通心粉，经乙醇二次回流法提取后，旋转蒸发至无醇，冻干，得到粗提莲心碱淡黄色粉末4.01 g。莲心碱淡黄色粉末粗提取率为16.04%。测定其吸光度，根据公式（2）和比尔定律换算成莲心碱的含量为401.38 mg/g。

采用粗提莲心碱粉末作为进一步分离纯化的样品。

2.2 大孔吸附树脂的选择

从表1可以看出，非极性树脂D101对莲籽心中的生物碱吸附优于弱极性树脂AB-8，证明非极性树脂易于吸附脂溶性的生物碱类。所以选择D101大孔树脂装层析柱进行下面的分离纯化。

表1 大孔树脂参数和静态吸附容量的比较

2.3 树脂吸附试验

①上样液浓度对吸附效果的影响 从图2中可以看出，在动态吸附过程中，随着上样液浓度的增大，树脂对生物碱的比吸附量随之增大。这是吸附的推动力浓差随上样液浓度的增大而增加导致的结果。当浓度到达一定程度时，生物碱在吸附树脂和溶剂中的分配系数会达到一个定值，此时的动态平衡称之为吸附平衡。图2中当上样液浓度小于10.0 mg/mL时，吸附继续进行。当浓度到达并且超过此平衡浓度时，由于浓差的作用力使树脂上的部分莲心生物碱被解吸，解吸下的分子在树脂中留下的位置在动态的短时间内来不及补上。因此，树脂在吸附12.5 mg/mL上样液中的生物碱时，导致吸附量略小于平衡浓度时的吸附量，因此最佳的上样浓度即为吸附平衡时的浓度10.0 mg/mL。

图2 上样液浓度对吸附效果的影响

②上样液的体积对吸附效果的影响 从图3可以看到，当上样液体积超过30 mL开始，上样液流出液中的莲心总碱含量开始明显上升，即在上样液为30 mL时，D101大孔树脂柱出现了吸附泄漏点。说明浓度10 mg/mL的上样液体积为30 mg/mL时，D101大孔树脂脂吸附量达到饱和点即吸附平衡，此时吸附量最大，继续增大上样液量，上样流出液中莲心碱的含量继续增大，而吸附量不再变化，导致物料的浪费。由此选择上样体积30 mL作为最佳条件进行上样液pH值的考察条件。

③上样液pH值对吸附效果的影响 由图4可以看出，当pH值在8、9时，树脂吸附量较大，pH值为9时吸附达量到最大值。pH值继续增大，比吸附量随之下降，不利于吸附。pH值为12时比吸附量降到最小。因此，选择上样液pH值9作为最佳条件，进行后续的洗脱试验。

2.5 树脂洗脱试验

①洗脱剂浓度对洗脱效果的影响 由图5可以看出，莲心总碱主要集中在乙醇浓度为30%～70%部分。乙醇浓度越大，洗脱效果越明显。乙醇浓度为15%～70%时，洗脱率明显上升，乙醇浓度为70%时，洗脱率达到88.29%，继续增加乙醇浓度，洗脱效果没有明显变化，说明洗脱接近平衡。因此选择70%乙醇作为洗脱剂最佳的洗脱浓度。

蒸馏水和10%乙醇部分几乎没有生物碱成分被洗脱，且洗脱液中均有一定量的固形物存在，说明蒸馏水和10%乙醇洗脱部分可以除去水溶性杂质。

②洗脱剂用量对洗脱效果的影响 从图6中可以看出，当乙醇用量过小时，洗脱效率很低，洗脱率随洗脱剂用量的增加而上升。而当洗脱剂用量达到4 BV时，洗脱率达83.80%，大部分莲心总碱得以洗脱。当乙醇体积超过4 BV时，虽然洗脱率会因为洗脱剂用量而增长，但在洗脱的过程中，对较难从树脂孔中解吸出的生物碱分子，洗脱率上升不明显，洗脱效果不再增加，且增多了洗脱剂用量和时间的消耗。因此，选择洗脱剂用量为4 BV作为最佳的洗脱剂体积。

③洗脱剂pH值对洗脱效果的影响 莲心生物碱在酸性条件下，易从吸附树脂上被乙醇洗脱，故选择了酸性洗脱路线。如图7所示，洗脱率随着洗脱剂的pH值上升而下降。H+浓度不但中和了吸附环境中所需的碱，也使生物碱之中的亲水氨基与其反应而挣脱吸附力，使生物碱分子更易于溶入乙醇溶液中。在pH值为1时，洗脱率为93.49%，达到最高洗脱率；pH值为2时洗脱率也能达到89.93%，差异不明显。但是在试验中调制pH值为1的洗脱剂需要耗费大量的盐酸，而且不利于树脂柱的再次吸附和再生，因此，选择pH值2作为洗脱条件。

图3 上样液的体积对吸附效果的影响

图4 上样液pH值对吸附效果的影响

图5 乙醇浓度对洗脱效果的影响

3 结论

通过大孔树脂对乙醇二次回流法提取的莲心总碱进行了纯化工艺优化研究得出，D101大孔树脂较适宜进行莲心总碱的纯化，其最佳的吸附条件为：上样液浓度10.00 mg/mL、pH值9、体积30 mL（0.43 BV）、流速1 mL/min，此工艺得到最大吸附量为9.55 mg/g；其最佳的洗脱条件为：乙醇浓度70%、pH值2、体积4 BV、流速1.4 mL/min，洗脱率达89.93%，经纯化后根据公式（4）计算得出最终得率为64.39%。

图6 洗脱剂体积对洗脱效果的影响

图7 洗脱剂pH值对洗脱效果的影响

[1]谢纲，曾建国.莲籽心的主要成分和药理作用研究进展[C] //中华中医药学会第八届中药鉴定学术研讨会，2007.

[2]徐虹，朱雨薇，曹杨，等.莲籽红皮多糖提取工艺研究[J].食品工业科技，2011，32（2）：266-268.

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[4]陈怡，罗顺德，宋金春，等.莲籽心中酚性生物碱3种主要成分定量分析及其特征图谱研究[J].中国医院药学杂志，2004，24（4）：205-208.

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[7]张京梅，李鹏跃，王岚，等.莲籽心总生物碱的提取分离及药效学初步研究[J].中国实验方剂学杂志，2009，15（6）：26-28.

Extraction and Purification of Alkaloids from Lotus Plumule Powder with Macroporous Resin

LI Lu1,2,XUE Shujing1,2,ZHOU Ming1,2,HE Jianjun1,2,GUAN Jian1,2, ZHANG Lingxiao3,YANG De1,2,GUO Peng1,2

In the paper,we extracted the alkaloids from lotus plumule powder by using the ethanol refluxing method,and used column chromatography to separate and purify alkaloids extracts further.The results showed that,D101 macroporous resin was more appropriate for purifying the alkaloids,and the maximum adsorbing capacity 9.55 mg/g was achieved with the following conditions:sample concentration 10.0 mg/mL,pH value 9,volume 30 mL(0.43 BV)and flow rate 1 mL/min. The best elution conditions were as follows:the ethanol concentration was 70%,with the pH value of 2,volume of 4 BV and flow rate of 1.4 mL/min,and the desorption ratio was up to 89.93%,while the final yield of the purified alkaloids was 64.39%.

Lotus plumule powder;Alkaloids;Macroporous resin;Purification

TS235.9

：A

：1001-3547（2013）18-0194-05

10.3865/j.issn.1001-3547.2013.18.073

国家科技支撑课题:水生蔬菜保鲜与加工技术研究（2012BAD27B03），湖北省农业科技创新中心项目（2013-620-007-001），“十二五”农村领域国家科技计划——粗粮固态产品的辐照杀菌技术研究（2012BAD34B08-15）

李露（1962-），女，本科，高级工程师，研究方向为功能食品薛淑静（1980-），女，通信作者，硕士，助理研究员，研究方向为食品科学，E-mail:xsj2000@163.com

2013-09-06