DEHP体外影响大鼠睾丸间质细胞Bax和Bcl-2基因表达的实验研究

吴维光，葛红雨，韩建秋

（武警后勤学院附属医院妇产科，天津 300162）

·论 著·

DEHP体外影响大鼠睾丸间质细胞Bax和Bcl-2基因表达的实验研究

吴维光，葛红雨，韩建秋

（武警后勤学院附属医院妇产科，天津 300162）

目的通过对原代培养的大鼠睾丸间质细胞进行邻苯二甲酸二乙基己酯（di-2-ethylhexyl phthalate，DEHP）染毒，探讨DEHP体外对大鼠睾丸间质细胞Bax和Bcl-2基因表达及凋亡的影响。方法体外分离和原代培养未成熟大鼠睾丸间质细胞，用不同浓度的DEHP（10、50、100nmol/L）染毒24h。荧光定量PCR法检测间质细胞Bax和Bcl-2基因mRNA表达，Weastern blot检测间质细胞Bax和Bcl-2蛋白表达，流式细胞术检测间质细胞凋亡率。结果与对照组相比，DEHP各组睾丸间质细胞Bcl-2基因mRNA和蛋白表达下降（P＜0.05），Bax基因mRNA和蛋白表达增加（P＜0.05），细胞凋亡率增加（P＜0.05），呈浓度依赖关系。结论DEHP可通过抑制Bcl-2基因表达和上调Bax基因表达诱导大鼠睾丸间质细胞凋亡，进而影响间质细胞功能。

邻苯二甲酸二乙基己酯；睾丸；间质细胞；大鼠

邻苯二甲酸酯（phthalates，PAEs）是一类人工合成有机化合物，可作为农药载体、驱虫剂、化妆品、香味品、润滑剂和去泡沫剂等生产原料，也是塑料产品生产中的添加剂。因其与塑料基质之间不形成共价键，而是以氢键和范德华力连接，故易从塑料中溶出而污染环境。在许多地方的大气、水体、土壤以及动物体内都可检测到PAEs［1］，在人体的血液、尿液、精液、羊水、母乳中也能检测到PAEs及其代谢产物［2-3］。在众多的PAEs种类中，邻苯二甲酸二乙基己酯（di-2-ethylhexyl phthalate，DEHP）用量最大，约占PAEs总量的50％。DEHP进入人体后可引起肝、肾、肺、心、生殖系统等脏器毒性损害，其中对雄性生殖系统的毒性损害已得到广泛的关注。睾丸中间质细胞是DEHP作用的靶细胞之一，其可通过影响间质细胞的结构和功能，进而影响生精过程。目前DEHP损伤间质细胞的机制还不十分清楚，本研究通过观察DEHP对体外培养的大鼠睾丸间质细胞Bax和Bcl-2基因表达作用以及对细胞凋亡的影响，探讨DEHP对睾丸间质细胞凋亡的诱导作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂：18～21日龄雄性SD大鼠10只，由天津医科大学实验动物中心提供。DMEM/F12培养基购于Gibico公司，Ⅰ型胶原酶、DEHP购于Sigma公司，FITC/PI双标凋亡试剂盒购于Invitrogen公司，Percoll分离液购于Pharmacia公司，Real-time PCRMaster Mix购于TaKaRa公司，Bax和Bcl-2兔抗鼠抗体购于Santa cruz公司，寡核苷酸引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 间质细胞的分离与培养：取雄性SD大鼠，断颈处死，无菌条件下取出睾丸，剥除较大血管，加入少许PBS（0.01mol/L，pH7.4）清洗后置离心管中，加入0.5g/L的Ⅰ型胶原酶，34℃振荡消化20min左右，待睾丸组织形成糊状刚好消失，但是生精小管连续而无断裂时，加入等体积的DMEM/F12培养液终止消化。细胞悬液过200目钢筛，滤液800r/min离心5min，弃上清，DMEM/F12培养液重新悬浮细胞，800r/min离心5min，弃上清，加入含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液，制成细胞悬液。加入预制冷的Percoll密度梯度离心液（梯度自上而下分别为30％、40％、50％、60％），800r/min低速离心30min，吸出第2条带细胞于离心管中，加入2倍体积的DMEM/F12培养液，1 000r/min离心5min，弃上清，加入DMEM/F12培养液，调整密度至106/mL，并接种于培养板中，于34℃、5％CO2条件下培养。通过3β-羟类固醇脱氢酶（3 beta-hydroxy steroid dehydrogenase，3β-HSD）免疫细胞化学法鉴定睾丸间质细胞的纯度约80％。

1.3 DEHP对间质细胞的毒性实验：将间质细胞接种于24孔培养板内，培养24 h后，换含DEHP的培养液，终浓度分别分10、50、100nmol/L，以只加DMSO的细胞作为对照，分别命名为DMSO对照组、DEHP低剂量组、DMHP中剂量组、DEHP高剂量组，细胞继续培养24h。

1.4 荧光定量PCR法检测Bax和Bcl-2基因mRNA：细胞总RNA和逆转录成cDNA按试剂盒说明进行，产物-20℃保存。采用7700全定量PCR仪（Applied Biosystems），以β-actin为内参照进行PCR。Bax基因引物序列，上游，5'-AGCGGCTGCTTGTCTGGAT-3'，下游，5'-TGAGGACTCCAGCCACAAAGA-3'；Bcl-2引物序列，上游，5'-TTCTCTCGTCGCTACCGTCG-3'，下游，5'-CCCTGAAGAGTTCCTCCACCA-3'。β-actin引物序列，上游，5'-ATTGCCGACAGGATGCAGAA-3'，下游，5'-ACATCTGCTGGAAGGTGGACA-3'。反应条件，95℃1min，95℃15s，60℃15s、72℃45s，共40个循环。计算目的基因相对表达量相对定量（relative quantification，RQ）值。

1.5 免疫蛋白印迹检测Bax和Bcl-2蛋白：裂解缓冲液提取细胞总蛋白，蛋白定量后取30μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳，将电泳后分离的蛋白电转至硝酸纤维素膜上，5％脱脂奶封闭，分别加Bax或Bcl-2兔抗鼠抗体，4℃过夜，TBST（tris-buffered saline-tween 20）洗3次，每次15min。再加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，室温下反应1.5h，0.1％含tween的TBST洗膜，增强化学发光压片显色，扫描并分析图像。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡率：操作按异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）/碘化丙啶（peropidium iodide，PI）-annexin V凋亡试剂盒说明书进行。各组细胞用4℃预冷的PBS洗涤细胞2次，250μL结合缓冲液重悬细胞，调整浓度为5× 106/mL。取100μL细胞悬液于5mL流式管中，加入5μL FITC/PI-annexin V，室温下避光孵育15min，离心弃上清，加入300μL结合缓冲液，流式细胞仪检测凋亡率，计数104个细胞。

1.7 统计学方法：应用SPSS11.5统计软件分析数据，计量资料以±s表示，多组间差异分析采用单因素方差分析，两组间比较采用q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠睾丸间质细胞形态学观察：经培养24h后，细胞都已经贴壁生长，低倍镜（×10）下见多数细胞伸展开来，成拉丝状或树突状，间质细胞核呈圆形或卵圆形，位于胞质中央，其胞质轮廓为多角形，一般有3～4个突起，有时可见有大小不一的空泡状结构。高倍镜（×40）下观察，细胞核清晰可见，有的细胞2～3个核仁，胞质内有空泡状结构，部分细胞边界不清（图1）。

2.2 Bax和Bcl-2基因mRNA表达检测结果：大鼠睾丸间质细胞经不同浓度DEHP处理24h后，Bax基因mRNA表达随DEHP剂量增加，表达增强，差异有统计学意义（P＜0.05）；Bcl-2基因mRNA表达随DEHP剂量增加而降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

2.3 Bax和Bcl-2蛋白表达检测结果：大鼠睾丸间质细胞经不同浓度DEHP处理24h后，经方差分析，Bax蛋白表达随DEHP剂量增加而增强，差异有统计学意义（P＜0.05）；Bcl-2蛋白表达随DEHP剂量增加而降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1，图3。

2.4 间质细胞凋亡检测结果：大鼠睾丸间质细胞经不同浓度DEHP处理24h后，随DEHP剂量增加，细胞凋亡率增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 间质细胞Bax和Bcl-2基因表达及细胞凋亡率检测结果Table 1 Results of Bax and Bcl-2 expressions and cell apoptosis rates

3 讨 论

DEHP对人类生存环境的严重污染，已成为世界范围内威胁人类生存和健康的一大公害。DEHP进入人体的途径主要有：①日常生活的接触，食品在加工、包装、储存、运输过程中受到污染，通过消化道进入体；空气中的DEHP和空气中溶胶粒子结合，通过呼吸道进入人体；含有DEHP物品，在使用中通过皮肤进入人体。②医疗活动，各种医疗设备包括输液设备、血袋等都是含有DEHP的塑料制品，在进行医疗活动中进入人体。③职业场所暴露，在工业生产中，DEHP会泄露到工作环境中。DEHP是一种脂溶性的环境雌激素，对处于生长发育男性胎儿、婴幼儿及成年男性的生殖系统都可产生毒害。动物实验［4-6］表明，暴露于DEHP的孕鼠，其雄性子代发生肛门生殖器距离缩短、乳头残留、睾丸下降不全、尿道下裂等几率增加。暴露于DEHP的雄性幼鼠，其睾丸发育差，体内雄激素水平降低。暴露于DEHP的雄性成年鼠，精液量少，精子数降低，体内雄激素水平降低。

睾丸组织主要由生精细胞、支持细胞和间质细胞组成，精子发生是一个极其复杂的过程，在这一过程中，曲细精管上皮在形态及生化方面均要经历周期性的变化。睾丸间质细胞分布在生精小管间的结缔组织中，其主要功能是产生睾酮，分泌的睾酮占睾酮总量的95％，与性功能维持、精子发生与成熟等生理过程密切相关。程序化细胞死亡亦称细胞凋亡，是在基因控制下的一种细胞自我消亡形式。睾丸间质细胞存在一定程度的凋亡，机体通过凋亡去除严重损伤、畸变和衰老的间质细胞，以维持间质细胞质量和数量的相对稳定，保证其发挥正常功能。但是间质细胞过度凋亡会使睾酮的分泌量减少，导致生精细胞凋亡增加，精子数量下降。睾丸组织中的间质细胞是DEHP雄性生殖毒性作用的靶细胞［7］。本研究结果显示，体外培养的大鼠睾丸间质细胞经10、50、100nmol/L DEHP作用后，间质细胞细胞凋亡率随DEHP浓度增加而增加。说明DEHP在体外诱导间质细胞发生凋亡。

睾丸间质细胞凋亡受多种因素和多基因调控，Bcl-2基因是人体最主要的抗凋亡基因，它编码的Bcl-2蛋白主要分布在线粒体外膜、细胞膜内表面、内质网膜及核膜等处。Bcl-2抗凋亡的机制目前认为主要有［8］：①拮抗促凋亡基因Bax；②抑制促凋亡的蛋白质细胞色素C自线粒体释放到胞质；③阻止胞质中的细胞色素C激活caspase通路；④有抗氧化及维持细胞内钙稳态等作用。Bax基因属于Bcl-2基因家族，编码的Bax蛋白可与Bcl-2形成异二聚体，对Bcl-2产生阻抑作用。研究［9］发现Bax/Bcl-2之间的比例关系是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素，bax是极其重要的促细胞凋亡基因之一［9］。Bax和Bcl-2基因在睾丸间质细胞中表达，多种对睾丸间质细胞损伤因素都可通过抑制Bcl-2基因表达和上调Bax基因表达而诱导间质细胞凋亡。本研究结果显示，体外培养的大鼠睾丸间质细胞经10、50、100 nmol/L DEHP作用后，间质细胞Bcl-2基因表达随DEHP浓度增加而下降，Bax基因表达随DEHP浓度增加而增加。说明DEHP在体外也可抑制睾丸间质细胞Bcl-2基因表达和上调Bax基因表达。

综上所述，DEHP对体外培养的大鼠睾丸间质细胞具有毒性作用，可通过抑制Bcl-2基因表达和上调Bax基因表达而诱导间质细胞凋亡。间质细胞凋亡增加可减少睾酮的分泌量，影响生精过程，最终导致精子数量减少，这可能是DEHP雄性生殖毒性的复杂机制之一。（本文图见封二）

［1］ GRADY R，SATHYANARAYANA S.An update on phthalates and male reproductive development and function［J］.Curr Urol Rep，2012，13（4）：307-310.

［2］ GUO Y，WU Q，KANNAN K.Phthalate metabolites in urine from China，and implications for human exposures［J］.Environ Int，2011，37（5）：893-898.

［3］ JENSEN MS，NøRGAARD-PEDERSEN B，TOFT G，et al. Phthalates and perfluorooctanesulfonic Acid in human amniotic fluid：temporal trends and timing of amniocentesis in pregnancy

EFFECT OF DEHP ON Bax AND Bcl-2 EXPRESSIONS IN RAT LEYDIG CELLS IN VITRO

WUWeiguang，GE Hongyu，HAN Jianqiu
（Department of Obstetrics and Gynecology，the Affiliated Hospital of Logistics College of Chinese People's Armed Police Forces，Tianjin 300162，China）

Objective To investigate the effects of di-2-ethylhexyl phthalate（DEHP）on the expressions of Bax and Bcl-2 genes，and on the apoptosis in rat Leydig cells in vitro.MethodsThe rat Leydig cellswere separated and cultured，and the Leydig cellswere treated with different concentrations of DEHP（10，50，100nmol/L）for 24h.Real time PCR was used to detectmRNA of Bax and Bcl-2 genes，and Western blot was used to detect the protein of Bax and Bcl-2.Furthermore，cell apoptosis rate was estimated by flow cytometry.ResultsCompared with the control group，the expressions of Bcl-2 mRNA and protein decreased（P＜0.05），and the expressions of Bax mRNA and protein in different DEHP groups increased（P＜0.05）in a concentration dependent manner respectively.Meanwhile，the cell apoptosis increased（P＜0.05）in a concentration dependent manner.ConclusionThe DEHP could induce apoptosis in rat Leydig cells by up-regulating the Bax gene expression and down-regulating the Bcl-2 gene expression，which results in Leyding cell dysfunction.

Di-2-ethylhexyl phthalate；testis；stromal cells；rats

R339.211

A

1007-3205（2013）02-0160-04

2012-04-05；

2012-07-22

吴维光（1967-），男，黑龙江大庆人，武警后勤学院附属医院副主任医师，副教授，医学博士，从事环境污染与生殖健康研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.02.013