当归药材HPLC指纹图谱研究

徐 魁 韩 勇

（山东省济宁市药品检验所，济宁272025）

当归药材HPLC指纹图谱研究

徐 魁 韩 勇

（山东省济宁市药品检验所，济宁272025）

目的 建立当归药材RP-HPLC指纹图谱，为科学评价及有效控制其质量提供可靠方法。方法 以0.3%磷酸（pH3.0）-乙腈为流动相进行梯度洗脱。色谱柱为PhenomenexC18（4.6mmX250mm，5μm），柱温30℃，检测波长290nm。结果 建立了当归的指纹图谱的质量标准，并对不同产地当归指纹图谱的相似度进行了分析，共有指纹峰13个，其中4号峰为阿魏酸，当归药材的相似度大于0.9。结论 采用高效液相色谱法建立当归药材的指纹图谱可靠、简便、重现性好，为提高当归药材质量控制标准提供参考。

当归；高效液相色谱法；指纹图谱

当归为伞形科植物［1-2］当归Angelica sinensis（Olive）Diels的干燥根，又叫秦归、云归、西当归和岷当归，生长于海拔1800～2500m高寒阴湿地区。当归主要化学成分为挥发油和水溶性两大部分。其药理作用有扩冠脉以及抗心律失常，对血液与造血系统也有显著的药理作用，并且具有抗肿瘤、抗炎和抗损伤等作用，因此，当归近年来成为研究的热点。本文采用高效液相色谱法研究了12批不同产地当归药材样品70%甲醇提取液的指纹图谱，并对主要成分阿魏酸进行了定位，为当归药材综合质量控制提供参考。

1 仪器和试药

1.1 仪器 DIONEX P680型高效液相色谱仪（美国戴安公司），Chromeleon Dionex工作站，UV-1800SPC型紫外可见分光光度（北京谱析通用仪器有限责任公司）。

1.2 试药 阿魏酸（ferulic acid）对照品购自中国药品生物制品检定所（110773-200611）。磷酸为天津化学试剂三厂产品（分析纯），甲醇为国药集团化学试剂有限公司产品（分析纯），三乙胺为上海凌峰化学试剂有限公司产品（色谱纯），乙腈为国药集团化学试剂有限公司产品（色谱纯），水为纯化水（自制）。s1当归对照药材购自中国药品生物制品检定所（120927-200613，甘肃）。12批当归药材为市售品：s2甘肃岷县，s3甘肃岷县，s4甘肃漳县，s5甘肃漳县，s6陕西凤县，s7陕西凤县，s8陕西凤县，s9云南丽江县，s10云南丽江县，s11云南丽江县，s12甘肃渭源县，s13甘肃渭源县，经作者鉴定匀为伞形科植物当归Angelicasinensis（Olive）Diels的干燥根。

2 方法与结果

2.1 检测波长的选择 根据当归的成分特征及文献资料检索，设置280、290、300、320nm四个波长对色谱条件进行考察，综合考虑基线、色谱峰个数、峰形及信号响应强弱，确定290nm为最佳检测波长。

2.2 阿魏酸对照品的制备 精密称取阿魏酸对照品0.01021g，至25ml容量瓶中，用70%甲醇溶解并稀释至刻度，再精密吸取3ml置于100ml容量瓶中，并用70%甲醇稀释至刻度。

2.3 当归供试品的制备［3-5］将上述当归药材粉碎（50目），精密称取0.5g置具塞三角瓶中，精密量取70%的甲醇25mL加入三角瓶中，密封，静置30min后进行超声处理60min，放置至室温，取上清液经0.45μm滤膜滤过。

2.4 色谱分析条件［6-8］色谱柱：PhenomenexC18分析柱（4.6mmX250mm，5μm），柱温：30±0.5℃。以阿魏酸为参照物，检测波长290nm，进样20μL，记录时间108min，流动相：（A）0.3%磷酸溶液（pH3.0）-（B）乙腈。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序（n，%）

2.5 对照品的选择 阿魏酸性质相对较稳定，峰形较好，基线较平稳，峰面积较大，故选阿魏酸作为对照品（S）。阿魏酸保留时间为45min，见图1。

图1 阿魏酸保留时间

2.6 精密度试验 取同一供试品溶液，连续进样5次，计算各主要色谱峰的相对保留时间RSD为0.027%～0.097%，相对的峰面积RSD为0.51%～2.7%，符合指纹图谱的检测要求。

2.7 稳定性试验 取同一批供试品溶液，分别在0h，2.5h，5h，7.5h，10h，24h进样，结果表明，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD≤3%，表明供试品溶液在24h内稳定。

2.8 重复性试验 取同一批当归药材粗粉（50目），分别精密称定，按“2.3供试品溶液制备”项下方法平行制备5份供试溶液，再分别按上述液相色谱条件测定，检测HPLC指纹图谱，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD≤3%，表明方法重复性良好。

2.9 当归HPLC指纹图谱的研究［9-10］

2.9.1 共有指纹峰的确定 分别精密称取12批当归药材及批当归对照药材，按“2.3项供试品的制备”项下制备供试品溶液，并按“2.4色谱条件”项下测定其指纹图谱，确定共有指纹峰13个，其中4号峰为阿魏酸。样品的出峰总数及其共有峰所占比例分别是S1（14，93%）、S2（17，77%）、S3（15，87%）、S4（16，81%）、S5（17，77%）、S6（15，87%）、S7（18，72%）、S8（14，93%）、S9（14，93%）、S10（17，77%）、S11（18，72%）、S12（16，81%）、S13（16，81%）。见图2。

图2 当归高效液相指纹图谱

2.9.2 当归指纹图谱的相似度评价 根据处理软件用中药色谱指纹图谱相似度评价软件2004A版（国家药典委员会）进行数据处理，即可计算出当归样品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度。S1～S13相似度分别为0.989、0.980、0.980、0.973、0.975、0.947、0.962、0.930、0.918、0.911、0.905、0.977和0.978。

3 结果与讨论

3.1 结果 通过测定，我们建立了当归的指纹图谱的检测标准，共有指纹峰13个，其中4号峰为阿魏酸峰，样品与当归对照品的相似度均在90%以上，平均相似度为95.58%。

3.2 讨论

3.2.1 提取条件的选择 分别以80%的甲醇、70%的甲醇、60%的甲醇作为提取溶剂，比较不同溶剂提取对指纹图谱的影响。分析结果表明，以70%的甲醇作为提取溶剂所得样品的指纹图谱峰数多于其它提取方式，且简便易行，故选择70%的甲醇作为提取溶剂。另取当归药材，以70%的甲醇作为提取溶剂，比较超声和回流两种不同提取方法、不同提取时间对色谱峰的影响。结果表明样品超声与回流提取差别不大，超声60min提取较完

全，故选择超声60min作为提取方法。

3.2.2 流动相流速优化 通过多次试验发现分别在0.45ml／min、0.9ml／min及1.2ml／min流速下逐步提高乙腈的比例进行色谱分析，分离出13个共有指纹峰并且不同极性的成分色谱峰分离度符合要求。若开始采用0.9ml／min的流速，则需降低乙腈的比例，为了更快的分离极性小的成分则需逐步大幅度提高乙腈的比例，这样乙腈的比例变化太大，从而导致基线飘移。为了保证各成分充分分离和基线稳定，最终决定用梯度洗脱方法进行分离，并最终确定流速分别为0.45ml／min、0.9ml／min、1.2ml／min的流速。

［1］南京中医药大学．中药大辞典［M］．上海科学技术出版社，2006：1207-1212．

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［3］马华侨，邸多隆，邵士俊，等．当归HPLC指纹图谱研究（Ⅰ）［J］．中草药，2004，（35）8：930-932．

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［9］屠鹏飞．高效液相色谱法制定中药材和中药注射剂特征指纹图谱的探讨［J］．中成药，2000，22（7）：516．

［10］国家食品药品管理监督局．关于印发《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）的通知》［S］．中成药，2000，22（10）：671．

Studies on the HPLC Fingerprints of Radix Angelicae Sinensis

Xu Kui Han Yong
(Jining City Institute for Drug Control,Jining,272025,China)

Absrracr：ObjecriveTo establish the RP-HPLC fingerprints of Radix Angelicae sinensis so as to control its quality．MerhodsA PhenomenexC18 column was used，with mixture liquid of 0.3%H3PO4（pH3.0）-CH3CN mobile phase in gradient mode．，the column temperature was maintained at 30℃．The wavelength of measurement was 290nm．ResulrsThirteen peaks have been gotten from Radix Angelicae sinensis as its fingerprints．The forth peak was ferulic acid and the similarity of samples was more than 0．9．ConclusionThe HPLC fingerprint method was repeatable，feasible in analysis of Radix Angelicae sinensis，and provides standard for the quality control of Radix Angelicae sinensis．

Radix Angelicae sinensis；HPLC；Fingerprints

10.3969／j.issn.1672-2779.2013.15.107

1672-2779（2013）-15-0159-03

张文娟

2013-05-18）