山茶花提取物预处理对小鼠脑缺血损伤的影响

卢炜卓 文继月 陈 攻 王 慧 褚世居 周晓隆

（合肥职业技术学院，安徽巢湖238000）

山茶花提取物预处理对小鼠脑缺血损伤的影响

卢炜卓 文继月 陈 攻 王 慧 褚世居 周晓隆

（合肥职业技术学院，安徽巢湖238000）

目的：探讨不同时相探讨山茶花提取物（extractof Camellia japonica L,ECJ）预处理对小鼠缺血再灌注损伤的影响。方法：线栓法制备小鼠缺血再灌注模型（MCAO),观察不同时相ECJ预处理后小鼠大脑中动脉缺血再灌注致脑梗死面积、血清中乳酸脱氢酶(LDH)和丙二醛(MDA)含量等指标的变化。结果：ECJ预处理延迟时相能明显减少脑梗塞面积并可明显降低血清中LDH活性、MDA的含量。结论：ECJ预处理延迟时相对小鼠脑缺血再灌注损伤有一定的保护作用。

山茶花提取物；脑缺血再灌注性损伤；预处理；丙二醛；乳酸脱氢酶

1986年Murry等[1]第一次发现狗的心脏在一个较长时间的缺血再灌注前给予几次短暂的缺血再灌注可以明显减轻心肌的损害。1990年Kitagawa［2］证实该现象同样存在于大脑，随后更多的实验证实了缺血耐受的器官的普遍性。脑缺血预处理的效应分为早期效应和延迟效应［3］，早期效应发生于预处理后数小时内，其机制与脑缺血预处理相似，主要与腺苷受体激活和KATP通道开放等相关；延迟效应发生在预处理后24-72h，与诸多基因表达的增强和受抑有关。缺血预处理是脑的内源性保护机制，具有潜在的临床应用价值，为临床治疗缺血性疾病开辟了新的方向，但是缺血预处理本身是伤害性应激过程，对机体是一种创伤，故其在临床应用上受到了很大的限制。因此，人们试图利用一些因子刺激机体产生内源性保护作用来模拟缺血预处理，其中对药物刺激机体引起的药理性预处理（pharmacological preconditioning，PP）的研究是近年来的热点。本室已研究发现而山茶花提取物预处理（pharmacological precongtioning of ECJ）早期时相对小鼠脑缺血再灌注损伤有明显的保护作用［4］，而中间时相和延迟时相是否具有保护作用却未见明确的报道，因此，本研究就山茶花提取物预处理中间时相和延迟对小鼠脑缺血再灌注损伤的影响进行了研究。

1.1 材料

1.药品与试剂

ECJ：是用乙醇提取法提取山茶花中的有效成分，用前用生理盐水（NS）溶解至所需浓度；尼莫地平注射液（nimodipine,Nim）山东方明股份有限公司出品；TTC（氯化三苯四唑啉2，3，5-triphenyl tetrazalium chloride,TTC），丙二醛（MDA），乳酸脱氢酶（LDH）均由南京建成生物研究所）。

1.1.2 动物

昆明种小鼠,♀♂兼用,体重20-25g,由安徽医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：皖医实动准第02号。

1.2 方法

1.2.1 分组

56只昆明种小鼠随机分成7组，每组8只，♀♂各半。模型组（MODEL）：大脑中动脉（MCA）线栓阻断血流60min，再灌注66h；缺血预处理组（IP）：MCA线栓缺血5min后灌注5min，再缺血5min灌注40h，随后缺血60min,再灌注24h；ECJ三个不同剂量组（15，30，60mg.kg-1）：持续5min静脉推注不同剂量ECJ，停止给药5min，再次持续静脉给药5min，40h后阻断MCA血流60min,再灌注24h;尼莫地平组（2 mg.kg-1）:给药及实验程序同ECJ组；假手术组：只手术但不阻断MCA。

取另1批小鼠，分组同上，进行缺血预处理或药物预处理10h后，行MCAO实验，观察预处理中间相对脑缺血损伤的影响。

1.2.2 动物模型

参照Longa［5］线栓法制作小鼠大脑中动脉栓塞（MCAO）模型。4%水合氯醛（100 mg·kg-1）腹腔注射麻醉小鼠后，分离右侧颈总、颈内及颈外动脉并结扎颈外动脉，在颈内、颈外分叉处剪一小口，将头端烧光滑的渔线插入至MCA起始部，进线深度约为14mm±1mm。实验结束后留取血清和脑，放入-20℃冰箱中冷冻保存，待测血清中LDH、MDA的含量。脑放入-20℃冰箱中速冻15min后制成2mm厚的冠状切片，置于2%TTC磷酸缓冲液中37℃避光恒温孵育30分钟，10%甲醛固定，根据梗死脑组织不着色，正常脑组织着深红色的原理，数码相机拍照后利用图象分析软件测量脑梗死面积。缺血灶体积=∑（An. T），An为各脑片上的缺血灶面积，T为每片脑片的厚度；同样的方法计算整个脑片的体积。计算缺血部分体积占全脑的体积的百分比［6］。

1．3统计方法

实验数据均以x±s表示，组间比较采用t检验，P<0.05认为有统计学意义。

2.结果

2.1 ECJ预处理延迟时相对小鼠脑缺血再灌注损伤的影响

2.1.1 ECJ预处理延迟时相对小鼠脑梗死体积的影响

见表1,模型组小鼠脑梗死体积显著高于假手术组（P<0.01）。与IP组一样，ECJ预处理在30mg·kg，60mg·kg-1可降低MCAO致小鼠脑组织梗死体积百分比的升高。预处理Nim也有类似的结果。

表1 ECJ预处理延迟时相对脑缺血小鼠脑梗死体积的影响（x±s，n=8）

2.1.2 ECJ预处理延迟时相对小鼠血清中MDA、LDH影响

见表2,与假手术组比较，模型组血清中MDA及LDH含量均有显著升高（P<0.01）。IP和Nim预处理可显著降低血清中MDA及LDH的增高（P< 0.01），在30 mg·kg-1，60mg·kg-1剂量，ECJ预处理亦可明显降低血清中LDH和MDA含量的升高。

表2 ECJ预处理延迟时相对小鼠血清中MDA及LDH含量的影响（x±s，n=8）

与假手术组相比,ΔP<0.01；与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01

2.2 ECJ预处理中间时相对小鼠脑缺血再灌注损伤的影响

见表3,模型组小鼠脑梗死体积显著高于假手术组。ECJ预处理在15-60 mg·kg-1范围内对MCAO致小鼠脑组织梗死体积无明显影响。

表3 ECJ预处理中间时相对脑缺血小鼠脑梗死体积的影响(x±s,n=8)

3.讨论

缺血预处理的保护作用分为两个时间相，早期保护出现在处理后即刻，持续1-3小时；延期保护，又称为第二时相出现在处理24小时后。而脑缺血性疾病是临床上常见的疾病，其致病率、致残率及致死率均较高。有研究表明采用轻度的脑缺血预处理可以改善致死性缺血性损伤所引起的神经元损害。而药理性预处理是在缺血预处理的理论基础上，可通过药物模拟缺血预处理样作用，对脑缺血及再灌注损伤产生保护作用，具有很好临床应用价值，目前发现不少药物药理性预处理均有保护作用，这些药物包括内毒素及其衍生物、3-硝基丙酸、吗啡类药物、NMDA受体阻断剂、尼莫地平等药物。

本研究发现ECJ(30，60 mg·kg-1)预处理40h后其后对小鼠MCAO 90min致缺血后脑梗死体积百分比增高有明显的抑制作用，不同程度的降低血清中LDH的活性和MDA的含量。而ECJ(60,30mg·kg-1) 10h对大鼠MCAO 90min致脑梗死体积百分比增高无明显的影响。本室以往的研究发现，ECJ预处理30min后对其后的脑缺血再灌注损伤亦有明显的保护作用。故而得出ECJ预处理对小鼠脑血再灌注损伤有明显的保护作用，并与缺血预处理对脑缺血再灌注损伤的保护作用类似，有明显的时间窗。其保护机制有待进一步的研究。

[1]Murry CE,Jennings RB,Reimer KA.Preconditioning with ischemia:a delay of lethal cell injury in ischemicmyocardium [J].Circulation 1986，74(5):1124-1136.

[2]Kitagawa K,Matsumoto M,Oda T,et al.Free radical gen eration during brief of cerebral ischemia trigger delayed neuronal death[J].Stroke,1990,35(3):551-558.

[3]Rejdak R,Rejdak K,Sieklucka-Dziuba M,et al.Brain tol erance and preconditioning[J].Pol JPharmacol,2001,53(1): 73-79.

[4]于治国.山茶花提取物预处理对脑缺血再灌注损伤的保护作用[J].铜陵职业技术学院学报，2011,10（4）：35-36.

[5]尹明华，洪森荣，邵兴华.山茶花提取物对脑缺血再灌注小鼠学习记忆损伤的改善作用[J].中国行为医学科学，2007，16（12）：1070-1071.

[6]罗胜勇，董六一，范丽，方明，陈志武.山茶花总黄酮对缺血性脑损伤的保护作用[J].中国临床药理学与治疗学，2004；8（10）：1157-1159.

（责任编辑：夏万夫）

R282.71

A

1671-752X（2013）01-0027-02

2012-11-28

卢炜卓（1978-），男，安徽巢湖人,合肥职业技术学院医学分院讲师，研究方向：药理学。

合肥职业技术学院自然科学类重点资助课题（编号：zrzd201103）。