多奈哌齐对侧脑室注射链脲菌素致痴呆大鼠的治疗作用

申东方 张丽伟 宋荣蓉

多奈哌齐对侧脑室注射链脲菌素致痴呆大鼠的治疗作用

申东方 张丽伟 宋荣蓉

目的研究多奈哌齐对脑室注射链脲菌素（STZ）致痴呆大鼠的治疗作用。方法健康SD雄性大鼠24只，随机分为对照组、模型组、多奈哌齐治疗组，每组8只。模型组和治疗组在手术的第1天和第3天分别向两侧侧脑室内注射STZ 3 mg/kg，对照组给予相同体积的柠檬酸缓冲液。多奈哌齐治疗组于手术前10 d给予多奈哌齐0.45mg/（kg·d）灌胃，术后持续8周，其余2组给予等量生理盐水。术后第10天、第8周行Morris水迷宫试验，观察大鼠学习记忆能力。术后8周处死大鼠取海马送电镜观察神经元凋亡情况。结果术后10 d水迷宫测试，与对照组比较，模型组与治疗组的潜伏期延长，过平台次数下降，差异有统计学意义（P＜0.01）。术后治疗8周，与模型组比较，治疗组的潜伏期缩短，过平台次数增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。电镜下观察多奈哌齐治疗组大鼠海马细胞结构细胞凋亡程度轻。结论侧脑室注射STZ制造大鼠痴呆模型稳定性高，多奈哌齐通过减轻AD模型鼠海马神经元的凋亡，从而起到改善临床症状的作用。

阿尔茨海默病；链脲菌素；多奈哌齐；神经元凋亡

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是老年人常见的神经系统变性病，是痴呆最常见的原因。其发病机制至今仍不十分清楚。脑内乙酰胆碱水平的降低可能是AD发生的机制之一［1］，抗胆碱酯酶药物多奈哌齐用于治疗AD病人，已被证明有效。链脲菌素（STZ）是一种烷基化物，大鼠脑室内小剂量注射STZ可被作为散发性AD的模型应用［2⁃3］。大量的临床研究表明，神经细胞凋亡参与AD的发生。本实验通过脑室注射STZ制作大鼠AD模型并应用多奈哌齐进行干预治疗，以探讨多奈哌齐对AD临床症状的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康SD雄性大鼠24只，2.5～3月龄，体质量200～250 g。由北京通利华实验动物技术有限公司提供。大鼠随机分为对照组、模型组、多奈哌齐治疗组，每组8只。

1.2 主要试剂及仪器设备 多奈哌齐（法国PFIZEK· PGM公司），STZ（美国sigma公司），10％水合氯醛，枸橼酸钠溶液（武汉博士德生物工程有限公司），Morris水迷宫（中国医学科学院药物研究所），大鼠立体定位仪（江西医疗器械研究所）。

1.3 模型制作方法

1.3.1 动物的筛选与分组：在实验前先将动物进行水迷宫初筛，测量大鼠对水迷宫学习与记忆的获取能力。按照Morris方法实验分为两部分：（1）定位航行实验：共历时5 d，每天上、下午各训练1次。训练时随机选取一个入水点，将大鼠面向池壁放入水中，记录大鼠寻找并爬上平台所需的时间（即潜伏期），每次训练时间为60 s。如果大鼠在60 s内未找到平台，须将其引至平台，这时潜伏期记为60 s，每次训练后让其在平台上停留15 s。（2）空间搜索实验：在第6天撤除水下平台，随机选取一个入水点，在同一个入水点将大鼠面向池壁放入水中，记录其在60 s内跨过原平台相应位置的次数和第1次通过平台的时间。通过初筛，去除先天痴呆（潜伏期平均值＞50 s）和游泳姿势不良者，将24只合格大鼠随机分为对照组、模型组和多奈哌齐治疗组，每组各8只。

1.3.2 动物模型的制作：水迷宫测试后48 h，SD大鼠腹腔注射10％水合氯醛（3 ml/kg）麻醉，参考《大鼠脑立体定向图谱Ⅲ》［4］，将大鼠的头固定于立体定位仪上，剪去局部毛发，消毒后沿矢状线切开皮肤，切口长约1.5 cm，将骨膜向两侧推开暴露颅骨，在前囟后1.5 mm、矢状缝侧方1.5 mm处钻孔，微量进样器垂直进入，深度距离脑表面3.5 mm，将STZ缓慢注入模型组及多奈哌齐治疗组大鼠。STZ溶于柠檬酸缓冲液中（pH 4.4），在手术的第1天和第3天分别向两侧侧脑室内注射，每次每侧注入约10μl（3 mg/kg）左右。对照组大鼠给予相同体积的柠檬酸缓冲液脑室内注射。每侧注入时间为5 min，留针5 min，缓慢出针。无菌骨蜡封闭钻孔，术区滴庆大霉素，缝合消毒。术后大鼠除给予普通饲料及自来水喂养外，牛奶灌胃4 d，青霉素肌注每日1次共5 d以防止感染。

1.3.3 各组大鼠的处置：多奈哌齐治疗组大鼠于手术前给予多奈哌齐0.45 mg/（kg·d）灌胃10 d，于侧脑室注射STZ术后再持续多奈哌齐灌胃治疗8周。对照组大鼠于手术前给予与治疗组等量生理盐水灌胃10 d。于侧脑室注射与治疗组等量柠檬酸平衡液，术后再持续生理盐水灌胃8周。模型组大鼠于手术前给予与治疗组等量生理盐水灌胃10 d。于侧脑室注射STZ后再持续生理盐水灌胃8周。

1.3.4 大鼠学习记忆能力观察：分别于术后第10天、第8周进行水迷宫试验，观察大鼠学习记忆能力。

1.3.5 海马神经元凋亡检测：术后第8周处死大鼠取脑海马部位，送电镜下观察神经元凋亡情况。电镜用固定液（本校电镜室提供）固定过夜，PBS漂洗，丙酮脱水，1％四氧锇酸后固定，环氧树脂包埋，超薄切片，枸橼酸铅染色，透射电镜下观察。PBS漂洗2次，2.5％的戊二醛固定后送哈尔滨医科大学电镜室观察。

1.4 统计学处理 采用SAS统计软件包对数据进行处理。所有数据均以±s表示，各组间数据进行方差分析，组间两两比较采用LSD检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑室内注射STZ后大鼠的一般情况 注射STZ后所有动物的体质量均较术前减轻，毛色发暗，不整齐，趋避力减弱。个别动物出现躁狂、抽搐等情况。术后48 h存活的大鼠绝大多数恢复正常。

2.2 各组大鼠学习记忆能力的变化 术前对照组、模型组、多奈哌齐治疗组的潜伏期、过平台次数无显著性差异（P＞0.05）。术后第10天，模型组、多奈哌齐治疗组潜伏期较对照组明显延长（P＜0.01）。过平台次数与对照组比较显著减少（P＜0.01）。术后给予药物治疗8周，多奈哌齐治疗组的潜伏期与模型组比较，显著缩短（P＜0.01），过平台次数显著增多（P＜0.01）。见表1，2。

表1 不同时期大鼠Morris水迷宫试验潜伏期（±s，s，n＝8）

表1 不同时期大鼠Morris水迷宫试验潜伏期（±s，s，n＝8）

注：与对照组比较，∗∗P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01

组别 术前 术后第10天 术后第8周对照组 17.37±9.10 16.30±5.35 17.08±7.31模型组 18.63±7.93 50.25±3.21∗∗49.65±6.81治疗组 18.18±7.93 48.60±8.21∗∗26.10±9.50△△

表2 3组大鼠过平台次数比较（±s，n＝8）

表2 3组大鼠过平台次数比较（±s，n＝8）

注：与对照组比较，∗∗P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01

组别 术前 术后第10天 术后第8周对照组 3.10±1.52 2.74±1.21 3.10±1.63模型组 3.20±0.99 0.70±0.32∗∗ 0.96±0.20治疗组 2.90±1.13 0.75±0.38∗∗ 3.01±1.38△△

2.3 细胞学改变 模型组海马细胞皱缩，表面微绒毛消失，线粒体嵴断裂或空泡变，核周板层体崩解形成髓样变，其他细胞器消失。多奈哌齐治疗组表面微绒毛丰富，细胞器结构和膜结构完好，胞质、核周板层体丰富，结构完整（图1）。

图1 模型组与治疗组海马细胞学改变（×2550）

3 讨论

AD是一种主要在老年期发生的以进行性智能衰退为主要特征的神经元退变性疾病，主要表现为持续进行性认知功能障碍而无缓解、记忆力衰退、性格和行为改变等。其病理特征为老年斑、神经元纤维缠结、海马锥体细胞空泡变性及神经元缺失。AD病因迄今不明。大量研究表明，脑内神经递质受体在AD发病中起着重要的作用［5］。随着神经元的缺失，各种神经递质也随之缺乏，其中最早也最明显的是乙酰胆碱。胆碱能受体除与大脑的学习和记忆功能有关外，还具有明显的神经保护作用［6］。随着疾病逐步发展，AD患者脑内乙酰胆碱水平迅速下降。但其降低的原因还未完全阐明。由于大量的神经元凋亡，导致大脑皮层出现萎缩。大体病理可见脑沟变宽，脑回变窄，脑室扩大。镜下可见老年斑、神经元纤维缠结和神经元减少等主要病理学特征。

多奈哌齐是一种具有高度选择性、可逆性的胆碱酯酶抑制剂，通过抑制胆碱酯酶而抑制乙酰胆碱降解并提高活性，改善神经递质的传递功能。大量研究显示，多奈哌齐能改善AD病人的胆碱能系统功能，提高认知能力［7］。

在人体进行AD研究有很多局限性，因此，建立可靠稳定的动物模型具有重要意义。STZ对机体组织毒性相对较小，动物存活率高，是目前国内外使用较多的制备糖尿病动物模型的方法。小剂量STZ侧脑室注射可以制备痴呆模型，却未使模型产生糖尿病。原因是侧脑室注射，使药物不能通过血脑屏障，不能对胰腺产生毒性作用，却可以对脑内胰岛素受体产生破坏作用，影响脑的能量代谢，引起神经元的破坏，从而引起痴呆。并未引起外周血糖的任何变化，说明其致痴呆性与血糖无关，但可引起大脑持久的葡萄糖和能量代谢障碍，不但使海马胆碱乙酰转移酶水平降低，还引起动物学习和记忆能力损伤。这个模型与人患AD的病理及临床特征相似，既出现认知功能的进行性恶化，也有脑葡萄糖和能量代谢功能的障碍［8］。

本实验结果显示，侧脑室注射STZ术后10 d，对大鼠进行Morris水迷宫测试，模型组与多奈哌齐治疗组的潜伏期与对照组比较明显延长，过平台次数明显下降，表明STZ侧脑室注射10 d后，大鼠的认知功能明显下降。侧脑室注射STZ制造大鼠痴呆模型可靠性好，稳定性高，与先前文献报道结果一致［3，9］。

术后给予多奈哌齐治疗8周，对大鼠进行Morris水迷宫测试，与模型组比较，多奈哌齐治疗组的潜伏期明显缩短，过平台次数明显增加，表明多奈哌齐治疗改善大鼠认知功能。

电镜下观察大鼠海马细胞结构，模型组海马细胞皱缩，表面微绒毛消失，线粒体嵴断裂或空泡变，核周板层体崩解形成髓样变，其他细胞器消失。多奈哌齐治疗组表面微绒毛丰富，细胞器结构和膜结构完好，胞质、核周板层体丰富，结构完整。表明多奈哌齐通过减轻AD模型鼠海马神经元的凋亡，从而起到改善临床症状的作用。

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（收稿日期：2013⁃05⁃14）

Effects of donepezil on ratsw ith A lzheimer's disease induced by intracerebroventricular injection of streptozotocin

SHEN Dong⁃fang，ZHANG Li⁃wei，SONG Rong⁃rong.Department ofNeurology，the Fourth Affiliated Hospital ofHaerbin Medical University，Haerbin 150001，China

Objective To investigate the effects of donepezil on rats with Alzheimer's disease（AD）induced by in⁃tracerebroventricular injection of streptozotocin. M ethods Twenty⁃four healthy SD rats were random ly divided into con⁃trol group，model group and donepezil treatment group（n＝8）.Donepezil treatment group received treatment of donepezil gavage（0.45 mg/kg·d））for10 days before surgery，and the treatmentwas continued for 8 weeks postoperatively.Mean⁃while，control group and model group received the same volume of saline.During the surgery，the streptozotocin dissolved in 0.9％Na citrate buffer was injected into both of the lateral cerebral ventricles（3 mg/kg）on the first and third day re⁃spectively in themodel group and treatmentgroup，and the same volume of citric acid bufferwas injected into cerebral ven⁃tricles in the control group.Each group was tested by Morrismaze to exam the abilities of learning and memory ability on the 10th day and 8 weeks after the operation，respectively.The neurological apoptotic status of hippocampus were studied by electron microscope 8 weeks after the operation. Results The latency of Morris maze was prolonged significantly（P＜0.01）and the time of passing through the platform was decreased significantly（P＜0.01）on the 10th day after the operation in both model and treatment group compared with control group.Eightweeks after the operation，the latency was decreased significantly（P＜0.01），the times increased significantly（P＜0.01），and the neurological apoptotic status of hippocampuswere less severe in treatment group compared withmodel group. Conclusions The ratmodel with AD in⁃duced by intracerebroventricular injection of Streptozotocin is stable.Donepezil could improve the learning and memory ability of ratswith AD，through alleviating the neurological apoptosis of hippocampus.

Alzheimer's disease；streptozotocin；donepezil；neurological apoptosis

R 749.16

A

10.3969/j.issn.1003⁃9198.2013.12.010

2013⁃07⁃25）

黑龙江省自然科学基金资助项目（0200869）

150001 黑龙江省哈尔滨市，哈尔滨医科大学附属第四医院神经内科

宋荣蓉，Email：songrongrong12＠163.com