对核仁组成区嗜银蛋白外周血染色的探讨

钟礼瀑，万祥辉

(1、江西省肿瘤医院输血科，南昌330029；2、江西省肿瘤医院检验科，南昌330029)

·实验研究·

对核仁组成区嗜银蛋白外周血染色的探讨

钟礼瀑1，万祥辉2

(1、江西省肿瘤医院输血科，南昌330029；2、江西省肿瘤医院检验科，南昌330029)

目的探索一种简便实用的能直接应用于外周血的核仁组成区嗜银蛋白染色方法。方法取25mm×55mm的双层滤纸贴盖于经固定的血片上，自然光条件下滴加按1：2现配的银胶溶液，放暗盒内30℃水浴染50min，水洗晾干，先低倍找到最佳部位后换油镜观察血膜染色后视野内背景清洁度、细胞结构和银染颗粒着色情况，并另作30 min和40 min同等条件对照。结果本法采用滤纸贴盖血膜面后，染液完全扩散于滤纸的时间较未用滤纸时以手工完全铺展液面的时间(即染色前试剂曝光时间)明显缩短，且利用了滤纸的过滤功能，使视野中杂质沉淀大为减少；适当延长染色时间能使细胞和银染颗粒着色程度加深，更易于检测识别。结论经此改进后的银染法可用于自然光条件下血片嗜银蛋白直接染色，适于各级医疗机构应用。

外周血；核仁组成区嗜银蛋白；染色法

核仁组成区嗜银蛋白(argyrophilic nucleolar organizer region proteins简称AgNOR)是rDNA转录过程中的调节蛋白，在核糖体和蛋白质的合成中起着重要作用。近些年，有关AgNOR在肿瘤病理诊断中的研究也不时可见报道，而其中的银染法由于其简单方便运用较多，但从报道来看，不管是在组织还是血膜中的应用其染色时间和温度仍不尽相同[1-6]。由于试剂的光不稳定性，在不避光条件下直接滴加银染应用液难免会受光分解，并在着色背景中产生大量棕黑色颗粒而妨碍检测。为了克服这种现象，寻找一种能在自然光条件下应用于外周血膜的银染方法，我们对此做了一些探索，经多次使用效果良好，现介绍如下。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料(1)先将88%的分析纯甲酸以重蒸水配成1%的溶液，再称2g生化试剂明胶充分溶于100ml此液中成2%的甲酸明胶溶液(简称A液)；最后称50g分析纯硝酸银充分溶于100ml重蒸水中(简称B液)，存于棕色磨口瓶中；(2)把双层洁净慢速定性滤纸紧贴着裁成25mm×55mm备用；(3)带秒表功能的Nokia 1208手机一部。

1.2 方法

1.2.1 操作过程(1)吸取病人未抗凝新鲜血液，迅即推制12张血片，其中6张编1～6号以无水甲醇(分析纯)固定5 min，洁净自来水柔缓淋洗30s后晾干；(2)取备用的双层滤纸贴放于其中1～3号(A组)血片上，另4～6号(B组)不放滤纸作同等条件对照，于每张玻片25㎜×55㎜面积内加600 μl计算所需应用液，按A液与B液1：2吸取各溶液量，立即放于干燥洁净棕色瓶中，充分混匀成应用液；(3)迅速吸应用液600μl分别加到A、B两组标本上，加液时启动秒表，当A组应用液自行扩散和B组手动铺散于整个标本面时，终止计时(以便计算A、B两组单个标本盖满液面的时间，即染色前试剂曝光时间)，立即放暗盒内在30℃水浴箱作用50min；(4)染色完毕，以洁净自来水轻柔淋洗30s，晾干，先低倍镜找到细胞分布均匀的部位后再换油镜观察每份标本视野背景的清洁度、红白细胞和银染颗粒着色程度。另6张血片分别编7～9号(C组)与10～12号(D组)，在上述同样方法和条件(但不计试剂曝光时间)下分别染色30min和40min(以便与A组对照观察红细胞、白细胞核、白细胞质和银染颗粒着色程度)，水洗晾干镜检。

1.2.2 标本镜检时视野内背景清洁度、细胞和银染颗粒着色程度判断标准(1)视野中背景清洁度判断标准：每份标本观察10个视野，以7个(含)以上视野的结果作为该标本最终结果，在视野背景中无颗粒或仅极少量尘粒状沉淀为-，当有G+球菌状暗褐色颗粒或尘粒状沉淀增多，但＜1/5视野面积为+，当G+球菌状暗褐色颗粒或尘粒状沉淀占视野面积1/5～2/5为2+，当G+球菌状暗褐色颗粒或尘粒状沉淀占视野内面积＞2/5～3/5为3+，当G+球

菌状暗褐色颗粒或尘粒状沉淀占视野内面积＞3/5～4/5为4+，G+球菌状暗褐色颗粒或尘粒状沉淀占视野面积＞4/5～5/5(满视野)为5+；(2)细胞和银染颗粒着色程度判断标准：每份标本观察10个视野，以7个(含)以上视野内细胞核、细胞质与银染颗粒未着色为“-”，呈黄白色为±，呈柠檬黄为+，呈桔黄色为2+，呈金黄或暗红色为3+，呈棕黑色为4+。

2 结果

2.1 A组滴加应用液后染液自行扩散和B组手动助其铺散的时间比较滴加应用液后1～3号标本染液自行完全扩散的时间分别为10.22s、9.19s和9.06s，平均9.63s；4～6号标本手动助染液完全铺散的时间分别为19.41s、13.59s和15.09s，平均16.03s；

2.2 镜检时视野内背景清洁度在镜下A组标本视野内背景清洁度均为-，B组标本视野内背景清洁度均为5+；

2.3 双层滤纸贴盖染色30 min、40 min、50 min后红细胞、白细胞核、白细胞质和银染颗粒着色程度(1)30min染色后C组3份标本视野内红细胞为-、白细胞核为±、白细胞质为-，银染颗粒为-；(2) 40min染色后D组3份标本视野内红细胞为±、白细胞核为+、白细胞质为-，银染颗粒为+；(3)50min染色后A组3份标本视野内红细胞为+、白细胞核为2+、白细胞质为±，银染颗粒为3+。3种不同染色时间具体染色效果见表1。

表1 30 min、40min、50 min3种不同染色时间双层滤纸贴盖染色效果对照

3 讨论

AgNOR银染一步法因无需特殊仪器，试剂组成中的硝酸银和明胶也易得，操作过程相对简单，人们乐于采用，但在有自然光的条件下要染出效果良好的血片并非易事，因硝酸银液一旦遇光即分解析出，产生沉淀，加上明胶溶液本身具有一定的黏附性，会促使沉淀的聚积，导致在染过的标本内形成大量沉渣，严重干扰银染颗粒的检测。故在无暗室条件下染色若要减少沉淀形成，就必须尽量缩短试剂染色前曝光时间。本实验采用双层滤纸贴盖血膜染色，干燥滤纸的强烈吸水性和其致密纤维网孔具有的巨大表面积对试剂的虹吸作用均能使试剂以极快的速度扩散于整个血膜，其扩散速度明显快于手工铺散试剂的速度，缩短了染色前试剂的曝光时间，湿润后的滤纸既可防止试剂蒸发干燥，还能滤除已形成的颗粒，这些作用相互叠加可大大减少沉淀生成，使染色背景变得清爽。在反应时间上，虽本法较有的报道[2-4]在染色时间上略长数分钟，但本法免除了复染水洗等程序，节省了试剂和后续过程所需的时间。再则，由于银染阳性呈现的黄色不甚醒目，观测的银染颗粒往往较微小，中性粒细胞核质较淋巴细胞核质疏松，其着色也较淋巴细胞核略浅，本着染色效果优先的原则，本实验经50 min染色后，红细胞、白细胞核和银染颗粒的着色程度均比其染色时间短的两组深染，故我们认为在30℃的常温条件下染50 min能更好地体现出本染色的应用价值，适于各级医疗卫生机构推广。

[1]孟江萍,尹一兵,邓一平.宫颈癌脱落细胞核仁形成区嗜银蛋白定量研究[J].江西医学检验,2005,23(4):339.

[2]杨玉琴.胸、腹水细胞AgNORs的检查对良恶性肿瘤诊断的体会[J],江西医学检验,2002,20(2):106.

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[4]韩益玲,钟璐,陈芳源,等.急性非淋巴细胞白血病细胞核仁组织区相关嗜银蛋白的研究[J].上海交通大学学报(医学版),2009,29(1): 74.

[5]李冰,徐丽萍.核仁组成区嗜银蛋白染色影响因素分析[J].滨州医学院学报2010,33(3):217.

[6]杜豫,许良中.恶性淋巴瘤核仁组成区染色对恶性程度诊断的价值[J].白血病,1995,4(4):197.

R446.11+1

A

1674-1129(2013)02-0131-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.02.009

江西省卫生厅科技计划项目(20091216)

钟礼瀑,男,本科,学士,主任技师,擅长血液细胞形态、生化和输血检验技术。