SUR1和KCNJ11基因多态性与磺脲类药物继发性失效的相关性研究

邵 倩，班 博，施锦绣

(1.山东大学医学院，山东济南 250012;2.济宁医学院附属医院内分泌科，山东 济宁 272029;3.上海人类基因组研究中心，上海 201203)

磺脲类降糖药物(SU)是一种胰岛素促泌剂，SU进入人体后作用于胰岛β细胞膜上的ATP敏感性钾离子(KATP)通道［1］，该通道是由磺脲类受体1(SUR1)及钾离子内向整流通道(Kir6.2)两种亚单位组成的异八聚体，通过将细胞膜电活动与细胞代谢联系起来，在胰岛素分泌中起着重要作用。长期应用SU，会出现磺脲类药物继发性失效(SFS)［2］，具体机制目前尚不明确。本研究选择调节KATP通道的SUR1、KCNJ11基因，采用SNaPshot技术对SUR1基因外显子16-3c/t、KCNJ11基因E23K多态性进行基因分型，并探讨与山东地区T2DM患者SFS的相关性。

1 材料与方法

1.1 资料

1.1.1 受试对象 选取2010年11月～2012年7月在山东济宁医学院附属医院住院的汉族T2DM患者200例(除外:糖尿病急性应激状态，如急性心肌梗死、脑卒中、糖尿病酮症酸中毒、糖尿病非酮症高渗性昏迷等;明显的肝、肾功能异常者;近期使用过影响肝、肾功能药物者)，诊断依据WHO1999年标准。SFS标准:曾经有至少3个月初始使用SU(或联合二甲双胍)的有效期，在适当饮食、运动基础上，SU加至每日最大剂量［如格列苯脲(优降糖)15 mg、格列吡嗪(美吡达)30 mg等］，失效持续1～3个月，尚未使用 INS，空腹血糖 ＞10.0 mmol·L-1，糖化血红蛋白＞9.0%。SU治疗有效组:糖尿病饮食控制加 SU(或联合二甲双胍)空腹血糖 ＜9.0 mmol·L-1，糖化血红蛋白＜8.4%。按照上述标准纳入SFS组86例(男42例、女44例)，SU有效组114例(男63例，女51例)，两组胰岛细胞表面抗体(ICA)、胰岛素抗体(IAA)和谷氨酸脱羧酶抗体(GAD-Ab)均阴性。所有对象在知情同意的情况下，签署知情同意书。

1.1.2 临床及生化数据 收集T2DM患者相关临床资料，包括年龄、性别、糖尿病病程、饮食控制等，测量身高、体重，计算体质量指数(BMI)，BMI=体重/身高2(kg/m2)。采用全自动生化分析仪(日本HITACHI公司)测定各组的空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)、餐后2h血糖(2 hours plasma glucose，2 hPG)、甘油三酯(triglycerides，TG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)等指标，采用单克隆抗体法检测糖化血红蛋白(glycated hemoglobin，HbA1c)，采用电化学发光法检测空腹C肽(fasting C-peptide，F-C)及标准馒头餐后2 h-C 肽(2 hours C-peptide，2 h-C)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 所有受检者取肘静脉血2ml，用EDTA-K2抗凝，采用盐析法抽提全血基因组DNA(QIAGEN，Germany)，应用 NanoDrop-1000(Nanodrop，USA)检测其浓度和纯度后，稀释至30 μg·L-1。

1.2.2 SNaPshot技术检测 (1)多重 PCR扩增:PCR 反应体系为 10 μl，含基因组 DNA 1 μl(30 mg·L-1)，0.3 μl的 dNTP(10 mmol·L-1)，1 μl 10 ×PCR 缓冲液，0.52 μl MgCl2溶液(25 mmol·L-1)，0.1 μl HotStar(Sigma 公司)，6.68 μl无核酸酶的去离子水，各引物对的终浓度为 0.1 μmol·L-1。多重PCR反应条件:95℃预变性15 min，94℃变性40 s，63℃退火1 min，每个循环下降0.5℃ ，72℃延伸1.5 min，15个循环;94℃变性40 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸1.5 min，25个循环;72 ℃ 8 min，4 ℃保存，PCR反应在9700热循环仪(ABI公司)中进行。(2)扩增产物的纯化:取1.0 μl扩增产物，加入2.0 U 虾碱性磷酸酶(SAP 酶，USB，USA)，2.0 U ExoⅠ酶(Epicentre Biotechnologies，USA)，去离子水 2.6 μl，反应总体系为 6 μl，混匀后 37 ℃保温 60 min，然后75℃灭活15 min，4℃保存。(3)延伸标记、纯化，反应体系为 5 μl，含纯化产物 2 μl，SNaP-shot Multiplex Mix(ABI公司)0.5 μl，引物1.2 μl，去离子水1.3 μl，每种引物在反应体系中的终浓度分别为0.2 μmol·L-1。PCR 循环条件为:96 ℃ 预变性10 s，96℃变性 10 s，50℃退火5 s，60℃ 延伸30s，25个循环，PCR反应在9700热循环仪(ABI公司)中进行。反应结束后进行第2次纯化，每反应产物中加入1U SAP酶，37℃保温60min，75℃灭活15 min，4℃保存。(4)每反应体系中加入Hi-Di甲酰胺(ABI公司)9.25 μl，内标 LIZ-120(ABI公司)0.1 μl，第 2 次纯化产物 1 μl，混匀离心后，95℃ 变性5 min，迅速冰冷4 min。于ABI公司3730遗传分析仪进行毛细管电泳，应用GeneMaperV 4.0软件进行数据分析。在所有样本中，每一个SNP的基因分型成功率＞98%。在随机抽取的样本中所有的重复分型的一致率均为100%(Fig 1)。

1.3 统计学分析以Hardy-Weinberg平衡法检验研究样本的群体代表性，用χ2检验比较SFS组与有效组之间基因型及等位基因频率分布。检验数据正态分布情况，正态分布计量资料以±s表示，非正态分布的资料采用自然对数转换为正态后进行分析，结果以中位数(25%位数，75%位数)表示，两组临床资料分析采用独立样本t或t＇检验。多因素分析用Logistic回归分析。上述数据处理运用SPSS 13.0统计软件。

2 结果

2.1 SUR1 16-3c/t基因型和等位基因分布频率SUR1基因外显子16-3c/t基因型频率在SFS组及有效组均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，SUR1基因外显子16-3c/t t/t、c/t和c/c基因型频率在SFS组分别为53.5%、34.9%和11.6% ，在有效组分别为 28.9%、55.3%和 15.8%，两组分布差异有统计学意义(P＜0.01)。SFS组“t”等位基因分布频率明显高于有效组(P＜0.01)，见Tab 1。

Fig 1 Genotyped result of SNaPshot

Tab 1 Distribution and frequency of SUR1，KCNJ11 genotypes and alleles between patients with secondary failure and without secondary failure

2.2 KCNJ11 E23K基因型和等位基因分布频率KCNJ11基因多态性位点E23K基因型频率在SFS组及有效组均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，SFS组 E23K KK、EK和 EE基因型频率分别为11.6%、55.8% 和 32.6%，在有效组中分别为15.8%、60.5% 和 23.7%，两组分布差异无统计学意义(P＞0.05)。见Tab 1。

2.3 研究对象的临床特点SFS组糖尿病病程、HbA1c、FPG、2 hPG 明显高于有效组(P ＜ 0.01)，2 h-C肽明显低于有效组(P＜0.01)，见Tab 2。

Tab 2 Analysis of clinical data in the 2 groups(±s)

Tab 2 Analysis of clinical data in the 2 groups(±s)

＊＊P ＜0.01 vs SU effective

Characteristics SU effective(n=114)SU failure(n=86)n(M/F)Age/y BMI/kg·m-2 Duration/y HbA1c/%FPG/mmol·L-1 2 hPG/mmol·L-1 F-C/nmol·L-1 2 h-C/nmol·L-1 TG/mmol·L-1 TC/mmol·L-1 HDL-C/mmol·L-1 LDL-C/mmol·L-1 86(42/44)56.9 ±8.7 25.4 ±3.3 10.0(6.0，14.0)＊＊10.8 ±1.6＊＊12.6 ±2.5＊＊20.6 ±3.5＊＊2.0 ±0.6 5.2 ±1.8＊＊2.0 ±0.8 4.9 ±1.3 1.2 ±0.3 2.8 ±0.7 114(63/51)56.2 ±9.4 25.0 ±2.6 4.0(2.0，8.0)7.8 ±0.4 7.6 ±1.0 16.8 ±3.1 2.1 ±0.7 7.9 ±2.3 2.2 ±0.8 4.9 ±0.7 1.2 ±0.2 2.8 ±0.8

2.4 SUR1基因外显子16-3c/t各基因型的临床及实验室资料比较SUR1基因外显子16-3c/t t/t基因型SFS发生率、FPG、HbA1c、2hPG明显高于 c/t+c/c型组(P ＜0.01)，而 BMI、2h-C 肽明显低于c/t+t/t型组(P ＜0.01)，见 Tab 3。

2.5 多因素Logistic回归分析以SFS是否发生为因变量，校正性别、年龄、BMI、F-C 肽、TG、TC、HDL-C、LDL-C后，发现SUR1基因外显子16-3c/t的t/t基因型是SFS的独立危险因素(OR=2.82，95%CI=1.57 ～5.07，P ＜0.01)。在回归中分别引入2 hPG(B)、2 h-C肽(C)、糖尿病病程(D)变量后，t/t基因型与SFS的相关性逐渐下降(均P＜0.05)，在回归分析中引入糖尿病病程＞5年(E)变量后，SUR1基因外显子16-3c/t的t/t基因型与SFS的相关性明显增加(OR=3.90，95%CI=1.27 ～11.98，P ＜0.05)，见 Tab 4。

Tab 3 Clinical data in different genotypes of SUR1 gene exon 16-3c/t(±s)

Tab 3 Clinical data in different genotypes of SUR1 gene exon 16-3c/t(±s)

＊＊P ＜0.01 vs c/c+c/t group

Characteristics c/c+c/t t/t n(M/F)Age/y BMI/kg·m-2 Duration/y SFS/n(%)HbA1c/%FPG/mmol·L-1 2 hPG/mmol·L-1 F-C/nmol·L-1 2 h-C/nmol·L-1 121(64/57)57.1 ±9.9 25.7 ±3.0 6.0(2.0，10.0)40(33.1)8.8 ±1.4 9.2 ±2.4 17.8 ±3.7 2.1 ±0.7 7.2 ±2.6 79(41/38)55.7 ±7.6 24.4 ±2.6＊＊7.0(3.0，14.0)46(58.2)＊＊9.7 ±2.1＊＊10.5 ±3.7＊＊19.3 ±3.8＊＊2.0 ±0.7 6.1 ±2.2＊＊

Tab 4 Logistic regression analysis of SFS risk factors

3 讨论

SU作为一种胰岛素促泌剂，通过与胰岛β细胞膜上的磺脲类药物受体(SUR)结合，关闭细胞膜上KATP通道，使钾离子外流减少，细胞膜去极化，导致电压门控性钙通道开放，钙离子内流，从而促进胰岛素的释放。近年来研究表明，KCNJ11、TCF7L2和IRS1等基因与 SFS有关［3-6］，但 SUR1基因与 SFS的关系报道较少。KCNJ11基因编码KATP通道的内向整流K+通道蛋白(Kir6.2)，SUR1基因编码KATP通道的调节亚单位SUR1，二者均在调节胰岛素的分泌中起着重要作用。

在本研究中，未发现KCNJ11基因E23K多态性与SFS相关(P＞0.05)，而在 UKPDS的研究中，也未发现E23K多态性与SU降糖疗效相关［7］，提示在中国人群中该多态性可能与SU降糖疗效无关。但是，本研究发现SUR1基因外显子16-3c/t多态性与SFS发生相关(P ＜0.05)，且“t”危险等位基因分布频率在 SFS组明显高于有效组(OR=1.87，P＜0.05)，该结果与袁莉等［8］的研究结果一致，而与Zychma等［9］的报道不同，Zychma等分析阴性结果的主要原因是SFS患者中包含了一部分成人隐匿性自身免疫性糖尿病(LADA)，而非真正的T2DM。此外，外显子 16-3c/t t/t基因型组的 FPG、2 hPG、HbA1c均明显高于其他基因型组，而2 h-C肽明显低于其他基因型组(P＜0.01)，提示t/t基因型携带者胰岛素分泌能力可能受损。多因素Logistic回归分析显示t/t基因型是SFS发生的独立危险因素(OR=2.82，P ＜0.01)，当分别引入 2 hPG、2 h-C 肽后及糖尿病病程后，t/t基因型与SFS的相关性下降(OR 值分别为2.45、2.30 及 2.23，均 P ＜0.05)，考虑到较长的糖尿病病程可能会影响SU疗效，对病程＞5年的患者进行逐步Logistic回归分析，发现t/t基因型仍是发生SFS的独立危险因素(OR=3.90，P＜0.05)，这表明遗传因素是SU降糖反应个体差异的最主要原因，外显子16-3c/t的t/t基因型携带者可能更易于发生SFS。推测可能机制:(1)由于该突变位于外显子16剪切部位上游，在转录过程中，可能影响了正常的剪接，使SUR1功能受到影响，从而影响胰岛素的释放。(2)可能与ABCC8基因上发生变异的其他功能性位点存在强烈的连锁不平衡［10］，影响了胰岛素的分泌功能。

综上所述，SUR1基因外显子16-3c/t多态性可能与SFS相关。随着SNPs的深入研究及药物基因组学的发展，SUR1基因的多态性将极大地促进个体化用药和新药的研究。如何对患者针对性的用药，避免或减少SFS风险的发生以及对新药的研发将成为我们今后的研究方向。

［1］ Bryan J，Crane A，Vila-Carriles W H，et al.Insulin secretagogues，sulfonylurea receptors and K(ATP)channels［J］.Curr Pharm Des，2005，11(21):2699-716.

［2］ 杨文英.磺脲类药物应用专家共识［J］.中华内分泌代谢杂志，2004，20(4):附录 4b-(1-4).

［2］ Yang W Y.Expert consensus of the application of sulfonylureas［J］.Chin J Endocrinol Metab，2004，20(4):Appendix 4b-(1-4).

［3］ Holstein A，Hahn M，Stumvoll M，et al.The E23K variant of KCNJ11 and the risk for severe sulfonylurea-induced hypoglycemia in patients with type 2 diabetes［J］.Horm Metab Res，2009，41(5):387-90.

［4］ Sesti G，Laratta E，Cardellini M，et al.The E23K variant of KCNJ11 encoding the pancreatic beta-cell adenosine 5＇-triphosphatesensitive potassium channel subunit Kir6.2 is associated with an increased risk of secondary failure to sulfonylurea in patients with type 2 diabetes［J］.J Clin Endocrinol Metab，2006，91(6):2334-9.

［5］ Holstein A，Hahn M，Körner A，et al.TCF7L2 and therapeutic response to sulfonylureas in patients with type 2 diabetes［J］.BMC Med Genet，2011，24(2):1-5.

［6］ Sesti G，Marini M A，Cardellini M，et al.The Arg972 variant in insulin receptor substrate-1 is associated with an increased risk of secondary failure to sulfonylurea in patients with type 2 diabetes［J］.Diabetes Care，2004，27(6):1394-8.

［7］ Gloyn A L，Hashim Y，Ashcroft S J，et al.Association studies of variants in promoter and coding regions of beta-cell ATP-sensitive K-channel genes SUR1 and Kir6.2 with Type 2 diabetes mellitus(UKPDS 53)［J］.Diabet Med，2001，18(3):206-12.

［8］ 袁 莉，郑 娟，陈璐璐，等.SUR1基因多态性与磺脲类药物疗效的相关性［J］.华中科技大学学报(自然科学版)，2004，32(2):89-90.

［8］ Yuan L，Zheng J，Chen L L，et al.Relationship between SUR1 gene polymorphism and therapeutic responsiveness of sulfonylurea drug in type 2 diabetes［J］.J Huazhong Univ Sci Tech(Nat Sci Edit)，2004，32(2):89-90.

［9］ Zychma M J，Gumprecht J，Strojek K，et al.Sulfonylurea receptor gene 16-3 polymorphism-association with sulfonylurea or insulin treatment in type 2 diabetic subjects［J］.Med Sci Monit，2002，8(7):512-5.

［10］ Yokoi N，Kanamori M，Horikawa Y，et al.Association studies of variants in the genes involved in pancreatic beta-cell function in type 2 diabetes in Japanese subjects［J］.Diabetes，2006，55(8):2379-86.