［C8 mim］Br 对聚球藻 7942 生长及生理特性的影响

邓祥元，高 坤 ，裴 峰，王长海

(1.江苏科技大学 生物与化学工程学院，江苏 镇江 212018;2.南京农业大学 江苏省海洋生物学重点实验室，江苏 南京210095)

与传统有机溶剂相比，离子液体(Ionic liquids)具有化学性质稳定、不易挥发、导电性强、易回收利用等优点，现已在电化学、化学反应和分离工程等领域显示出广阔的应用前景［1－2］，但由于其水溶性强，在水中不易降解［3］，释放到水环境中可能会造成水体污染，已有研究表明离子液体对绿藻、大型蚤及斑马鱼等水生生物及群落结构等具有毒性效应［4－6］，并表现出烷基链效应“(alkyl side chain effect)”和“截止效应(cut off effect)”［2］。

咪唑类离子液体作为应用最广泛的一类离子液体，近年来研究其对水生生物影响的工作已经开展，但有关其对微藻生长及生理特性影响的研究较少。而微藻是水生生态系统的初级生产者，具有繁殖能力强、适应性广、易培养、对污染物敏感等特点，可作为污染物毒性效应评估的生物模型。本文以聚球藻7942(Synechococcus sp.PCC 7942)为实验材料，研究 1 － 辛基 －3 － 甲基咪唑溴盐(1 － octyl －3 － methylimidazolium bromide;［C8mim］Br)对其生长及生理特性的影响，探讨［C8mim］Br 对聚球藻可能的毒性作用机制，为评价［C8mim］Br 对微藻的毒性效应及其环境风险积累提供数据资料和科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

聚球藻7942(Synechococcus sp.PCC 7942)由中国水产科学研究院黄海水产研究所张晓雯教授馈赠。在无菌条件下，将藻种转接到BG－11 培养基［7］中。培养条件为:温度25 ℃，光强度3 000 lx，光周期为12 h L:12 h D。

1 －辛基－3 －甲基咪唑溴盐(［C8mim］Br)购自上海成捷化学有限公司，纯度为99%;其余试剂均为上海国药集团化学试剂有限公司生产的分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 藻种的活化、培养与生长抑制试验 用作生物测试的藻必须是处于对数期并且是同步化生长的细胞，因此在正式测试之前，首先要进行藻类的同步化培养［8］。将聚球藻7942 在无菌条件下转移至BG－11 培养基中，于光照培养箱中驯化培养7 d，至对数生长期后进一步扩大培养(培养条件为:温度25 ℃，光强度3 000 lx，光周期为12 h L:12 h D)，静置培养，每天定时人工摇动3 次。

参照OECD201 藻类生长抑制实验的标准方法［9］，聚球藻接种后(初始密度为6.5 ×106 cells/mL)，根据预试验结果加入［C8mim］Br，使其终浓度分别为 0、2.5、5、10、20 和 40 mg/L，每个处理组和对照均设3 个平行，静置培养，每天定时人工摇动3 次。

1.2.2 细胞密度的测定 定时取样0.2 mL，采用血球计数板法测定藻细胞密度。

1.2.3 粗酶液提取、蛋白质含量及超氧化物歧化酶（ Superoxide dismutase，SOD） 、丙二醛（ Malondialdehyde，MDA） 含量的测定 取处理 96 h 的藻液 40 mL，5 000 r/min 下离心 10 min 收集藻细胞，加入0.05 mol/L的磷酸缓冲液1 mL(pH 值为7.8)，利用超声波细胞破碎仪冰浴破碎细胞10 min(其间工作5 s，间隙20 s)，镜检无完整细胞然后于12 000 r/min 离心下10 min，上清液即为粗酶液。

蛋白质含量、SOD 活性和MDA 含量的测定参照南京建成生物工程研究所的蛋白质含量测定试剂盒(货号:A045 －2)、SOD 试剂盒(货号:A001 －1)和 MDA 试剂盒(货号:A003 －1)说明书进行。

2 结果与分析

2.1 ［C8mim］Br 对聚球藻生长的影响

［C8mim］Br 对聚球藻生长的影响如图1 所示。由图可知，加入［C8mim］Br 处理后12 和24 h 时，处理组与对照组中聚球藻的生长未表现出显著差异(P ＞0.05)，但随着处理的延长(48、72、96 h)，处理组中聚球藻的生长受到明显抑制，如处理 96 h 时，在2.5、5、10、20、40 mg/L［C8mim］Br 的处理组中，聚球藻的细胞密度仅为对照组的34.1%、31.1%、25%、44.7%、31.8%，而且随处理时间的延长，这种抑制效应越明显。

图1 不同浓度［C8mim］Br 对聚球藻生长的影响Fig.1 Effects of different concentrations of［C8mim］Br on the growth of Synechococcus sp.PCC 7942

图2 ［C8mim］Br 胁迫下聚球藻中可溶性蛋白含量的变化Fig.2 Changes of soluble protein contents in Synechococcus sp.PCC 7942 under the exposure of［C8mim］Br

2.2 ［C8mim］Br 胁迫下聚球藻中蛋白质含量变化

作为生物体构成的主要物质，蛋白质是生命功能的执行者，在生物体中具有重要作用。图2 显示了［C8mim］Br 胁迫下聚球藻中可溶性蛋白含量的变化情况，由图2 可知，随着［C8mim］Br 浓度的增加，聚球藻中蛋白质含量先上升后下降，在5 mg/L 处理组中，蛋白质含量达到最大值(16.15 μg/107cells)，约是对照组(7.07 μg/107cells)的2.29 倍;当［C8mim］Br 浓度高于 5 mg/L 后，聚球藻中蛋白质含量逐渐降低，在40 mg/L 处理组中，蛋白质含量仅为9.20 μg/107cells。以上结果表明，低浓度［C8mim］Br 诱导聚球藻合成较多的蛋白，这可能是由于在低［C8mim］Br 浓度条件下，聚球藻中相关抗氧化酶、生物转化酶等相关蛋白质含量的增加有关，这些酶在藻细胞抵御非生物胁迫过程中起着重要作用［10］。但在高浓度(＞20 mg/L)条件下，［C8mim］Br 可灭活聚球藻中相关抗氧化酶的活性，并抑制相关可溶性蛋白的合成。

2.3 ［C8mim］Br 胁迫对聚球藻中SOD 活性的影响

SOD 酶是生物体内重要的保护酶之一，可有效清除生物体内的活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)。图3 显示了［C8mim］Br 胁迫下聚球藻中 SOD 酶活力的变化情况，由图3 可知，随着［C8mim］Br 浓度的增加，SOD 酶活力先上升后下降，这与藻细胞内蛋白质含量的变化趋势类似，说明低浓度［C8mim］Br 提高藻细胞内SOD 酶的活力，以清除过量的ROS;但高浓度的［C8mim］Br 可灭活SOD酶的活力。

图3 不同浓度［C8mim］Br 对聚球藻中SOD 活性的影响Fig.3 Effects of different concentrations of［C8mim］Br on the SOD activity in Synechococcus sp.PCC 7942

图4 ［C8mim］Br 胁迫对聚球藻中MDA 含量的影响Fig.4 Effects of［C8mim］Br exposure on the MDA contents of Synechococcus sp.PCC 7942

2.4 ［C8mim］Br 胁迫对聚球藻中MDA 含量的影响

丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的产物之一，与藻细胞在逆境胁迫下遭受伤害及活性氧积累诱发的膜脂过氧化作用密切相关，通常利用它作为膜脂过氧化强弱的一个重要指标。［C8mim］Br 胁迫对聚球藻中MDA 含量的影响如图4 所示，由图可见，随着［C8mim］Br 浓度的增加，细胞中MDA 含量逐渐上升，在40 mg/L 处理组中，藻细胞内MDA 含量达到最大值，为0.98 nmol/107cells，表明随着［C8mim］Br 浓度的升高，膜脂过氧化加剧，细胞损伤严重。

3 小结与讨论

近年来，离子液体因具有独特的物理化学性质，逐渐成为了国际上研究的前沿和热点，并在化学化工领域的相关行业中得到了广泛的应用，但与其环保问题相关的研究未得到足够的重视，导致有关其毒性的相关数据较少，无法对其环境危害性进行正确评估［11］。

本文以聚球藻7942 为实验材料，初步研究了［C8mim］Br 对其生长及生理特性的影响，研究结果表明:［C8mim］Br 严重抑制聚球藻7942 的生长，这可能是由于［C8mim］Br 可改变藻细胞中的脂类、纤维素等大分子物质的结构［12］，导致细胞变形、分裂，从而影响藻类正常的新陈代谢和生理过程。段炼等［13］通过透射电镜观察发现:1 －丁基 －3 －甲基咪唑氯盐(［BMIM］Cl)可造成斜生栅藻(Scenedesmus obliqnus)细胞的质壁分离，体内叶绿体片层断裂，线粒体嵴数量减少等;且对其细胞膜的通透性具有一定程度的破坏作用。因此，离子液体对生物体的毒性一方面可能是通过破坏细胞膜的通透性，进而破坏细胞结构引起的，这与攻击脂质结构的清洁剂、杀虫剂和抗生素等的机理类似。另一方面，［C8mim］Br胁迫下，聚球藻细胞内会发生显著的生理生化反应，如SOD 酶活力先上升后下降，MDA 含量明显升高(图3 和4)，表明细胞中ROS 的产生和消除间的平衡被破坏，ROS 的积累导致细胞膜被破坏，藻细胞生长受到抑制［14］，因此，［C8mim］Br 亦可通过诱导产生过量的ROS，造成对藻细胞膜结构的破坏，进而影响藻细胞生长。

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