山梨酸苯丙氨酸乙酯的合成及抑菌活性

曾广翔，陆惠邦，孙胜玲，宁正祥，苏 兰，韦庆益，*

（1.华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510641；2.中国科学院广州地球化学研究所，同位素地球化学国家重点实验室，广东广州510640）

食品是人类赖以生存的基本物质，它提供给人类生活所需要的各种营养素和能量。通过消耗食品中的营养物质，细菌、酵母和真菌等可以迅速繁殖，从而导致食品发生微生物感染[1]。随着生活水平的提高，人们越来越注重食品的质量问题。因此，增强食品的安全性是十分有必要的。利用合成的化学食品防腐剂来控制微生物的生长以及防止食品腐败，是最常用的方法之一[2]。目前，国内常用的食品防腐剂按成分和来源不同，主要分为酯型防腐剂、酸性防腐剂、生物防腐剂和无机防腐剂四类[3-4]。食品防腐剂的构效研究表明：α、β-不饱和羰基结构是食品防腐剂具有抗菌活性的有效功能性结构之一[5]。本文以山梨酸、苯丙氨酸和丙醇为原料，通过酰氯的方法对山梨酸进行改性，合成具有广谱抑菌作用的化合物山梨酸苯丙氨酸丙酯。此药物有望作为新型的食品防腐剂，也有望应用于化妆品、皮具、木材等领域的防霉抗菌，具有广泛的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

山梨酸 化学纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；L-苯丙氨酸 含量≥98.0%，上海伯奥生物科技有限公司；乙醇 分析纯，上海市凌峰化学试剂有限公司；氯化亚砜 分析纯，天津市光复精细化工研究所；氢氧化钠、石油醚（Ⅰ）、氯化钠、蔗糖、无水葡萄糖 分析纯，广州化学试剂厂；乙酸乙酯 分析纯，国药集团化学试剂有限公司；硅胶粉 100～200目，上海谊恒工贸有限公司；牛肉膏、琼脂粉 广东环凯微生物科技有限公司；蛋白胨 北京奥博星生物技术有限责任公司；马铃薯 市售；营养肉汤培养基 用于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、牛奶酸败混合菌的培养；马铃薯培养基 用于酿酒酵母和黑曲霉的培养[6]；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtili）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、牛奶酸败混合菌、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、黑曲霉（Aspergillus niger） 由华南理工大学轻工与食品学院提供。

AvanceIII 400核磁共振仪 瑞士布鲁克公司；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器 巩义市英浴高科仪器厂；RE-S2型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；SHZ-D（Ⅲ）型循环水式真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司；S20型实验室pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；YX-18LD型手提式压力蒸汽灭菌锅 江门滨江医疗设备有限公司；THZ-82A型水浴恒温振荡器 常州澳华仪器有限公司；721G型可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；SPX-100B-Z型生化培养箱 上海博讯实业有限公司设备厂。

1.2 实验方法

1.2.1 山梨酸苯丙氨酸乙酯的合成 苯丙氨酸乙酯盐酸盐的合成：向装有低温温度计的100m L三口烧瓶中加入无水乙醇30m L。向其中加入一定比例的苯丙氨酸和氯化亚砜，冰盐浴中反应1h，再加热回流，直至固体完全消失。利用旋转蒸发仪减压除去剩余的乙醇及SOCl2，得到中间体苯丙氨酸乙酯盐酸盐[7-9]。

山梨酸的酰氯化反应：向100m L圆底烧瓶中加入摩尔比为1∶3的山梨酸和氯化亚砜，在常温下搅拌反应1h。利用旋转蒸发仪减压除去剩余的SOCl2，得到酰氯化后的山梨酸。

山梨酸苯丙氨酸乙酯的合成：向100m L圆底烧瓶中加入摩尔比为1∶1的苯丙氨酸乙酯盐酸盐和酰氯化后的山梨酸，冰盐浴反应3h，室温反应4h。利用旋转蒸发仪减压除去低沸点物质，得到山梨酸苯丙氨酸乙酯粗品（图1）。合成山梨酸苯丙氨酸乙酯反应式如下：

图1 山梨酸苯丙氨酸乙酯反应式Fig.1 Synthesis of ethyl N-[1-oxo-2，4-hexadien-1-yl]-L-phenylalaninate

1.2.2 苯丙氨酸乙酯盐酸盐工艺参数优化实验

1.2.2.1 单因素实验 固定苯丙氨酸与氯化亚砜摩尔比1∶3，反应温度60℃，考察反应时间分别为2、3、4、5、6h时对苯丙氨酸乙酯盐酸盐收率的影响。固定苯丙氨酸与氯化亚砜摩尔比1∶3，反应时间4h，考察反应温度分别为50、60、70、80、90℃时对苯丙氨酸乙酯盐酸盐收率的影响。固定反应时间4h，反应温度60℃，考察苯丙氨酸与氯化亚砜摩尔比分别为1∶2.0、1∶2.5、1∶3.0、1∶3.5和1∶4.0时对苯丙氨酸乙酯盐酸盐收率的影响。

1.2.2.2 正交实验 为了优化反应条件和提高反应收率，在单因素条件实验的基础上，以苯丙氨酸乙酯盐酸盐的收率为考察指标，选择反应时间（A）、反应温度（B）和物料配比（C）为考察因素，以收率为考察指标，进行正交实验，其正交实验因素与水平见表1。

表1 正交实验因素与水平Table1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.3 苯丙氨酸乙酯盐酸盐收率的计算 公式如下：

1.2.4 产物的分离纯化 用乙酸乙酯对合成产物进行萃取，再用浓度为20g/L的NaOH溶液进行洗涤初步纯化，最后经层析柱（固定相为硅胶粉，流动相为石油醚∶乙酸乙酯=2∶1）进一步纯化后，得到纯品山梨酸苯丙氨酸乙酯。

1.2.5 最低抑菌浓度（M IC）测定 最低抑菌浓度的测定采用平板涂布法：将不同浓度的防腐剂溶液加入到已经灭菌的培养皿中，然后加入一定体积的培养基，充分混合以达到所需要的浓度。待培养基冷却后，加入等量的菌悬液0.1m L，用涂布器涂布均匀，置于37℃（细菌）培养24h；28℃（酵母）培养48h；28℃培养72h（霉菌）。观察菌体的生长情况，从无菌生长的培养皿中找出最低药物浓度的培养皿，此皿的药物浓度即为该药物的最低抑菌浓度[10-11]。

1.2.6 微生物生长曲线测定 采用比浊法，100m L无菌营养肉汤液体培养基中，接入0.5m L牛奶酸败混合菌菌液，37℃恒温培养，测定不同培养时间样品在560nm波长下的吸光值A560。以时间为横坐标，吸光值A560为纵坐标，绘制微生物生长曲线[12-13]。抑菌率按下式计算：

式中：△t，k和△t，i分别为空白与样品在t时刻A560与接种时（t=0）A560相比的增量[14]。

1.2.7 核磁共振 以四甲基硅烷为内标物，其化学位移值为0，以氘代氯仿为溶剂，测定样品的1H核磁共振谱。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 反应时间对苯丙氨酸乙酯盐酸盐收率的影响

由图2可知，当反应时间为2h时，苯丙氨酸乙酯盐酸盐的收率只有40.7%。随着反应时间的增加，苯丙氨酸乙酯盐酸盐的收率也相应增大。当反应时间为4h时，苯丙氨酸乙酯盐酸盐的收率达到最高，为89.4%。而继续增加反应时间，苯丙氨酸乙酯盐酸盐的收率略有下降，可能是由于时间过长导致副产物增多缘故。

图2 反应时间对苯丙氨酸乙酯盐酸盐收率的影响Fig.2 The effect of reaction time on the yeild of L-Phenylalanine ethyl ester hydrochloride

2.1.2 反应温度对苯丙氨酸乙酯盐酸盐收率的影响

由图3可知，当反应温度低于60℃时，苯丙氨酸乙酯盐酸盐收率随着反应温度的增加而增加；当反应温度大于60℃时，苯丙氨酸乙酯盐酸盐收率随着反应温度的增加而略有降低，可能是由于温度过高导致氯化亚砜不断挥发，从而降低了氯化亚砜和乙醇分子碰撞的机会，进一步影响最终产率。

图3 反应温度对苯丙氨酸乙酯盐酸盐收率的影响Fig.3 The effectof reaction temperature on the yield of L-Phenylalanine ethyl ester hydrochloride

图4 物料配比对苯丙氨酸乙酯盐酸盐收率的影响Fig.4 The effectofmaterial ratio on the yield of L-Phenylalanine ethyl ester hydrochloride

2.1.3 苯丙氨酸与氯化亚砜的摩尔比对苯丙氨酸乙酯盐酸盐收率的影响 由图4可知，当苯丙氨酸与氯化亚砜的摩尔比为1∶3时，苯丙氨酸乙酯盐酸盐收率较高。继续增加氯化亚砜用量，苯丙氨酸乙酯盐酸盐收率反而下降。这是因为氯化亚砜极易挥发，部分过量有利于反应进行，但当氯化亚砜的量增加到一定程度时，便加大了氯化亚砜双键聚合的可能性，导致收率下降。

2.2 苯丙氨酸乙酯盐酸盐正交实验

苯丙氨酸乙酯盐酸盐正交实验结果如表2所示。从表2极差R的大小可以看出，影响苯丙氨酸乙酯盐酸盐收率的因素大小依次为：B＞C＞A，即主次顺序依次为：反应温度、物料配比、反应时间。由k值可得合成苯丙氨酸乙酯盐酸盐的工艺条件为A1B2C3，即反应时间3.5h、反应温度60℃、苯丙氨酸与氯化亚砜的摩尔比1∶3.2。验证实验表明，此条件下苯丙氨酸乙酯盐酸盐的收率为93.8%。

表2 正交实验设计与结果Table2 Design and results of orthogonal test

2.3 产物表征

表3 山梨酸苯丙氨酸乙酯的1H NMR谱数据Table3 1H NMR data of ethyl N-[1-oxo-2，4-hexadien-1-yl]-L-phenylalaninate

产品为浅黄色固体，熔点69.8～72.2℃。其1H NMR谱数据如表3所示，1H NMR可提供化学位移、峰面积积分值、自旋分裂数和耦合常数几方面的数据，根据这些数据可对产物的结构进行鉴定。从表3可以看出，氢原子总数为21个，与山梨酸苯丙氨酸乙酯分子式的氢原子数一致。另外，H的化学位移值与氢原子所在官能团的位置呈一一对应关系，其与山梨酸苯丙氨酸乙酯结构式的氢原子位置一致。因此，可确定产物为山梨酸苯丙氨酸乙酯。

2.4 最低抑菌浓度测定

由表4可知，山梨酸苯丙氨酸乙酯对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和牛奶酸败混合菌的最低抑菌浓度分别为2.50、0.75、2.00、2.50mmol/L，与山梨酸抑菌效果相当，其中对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌抑菌效果优于山梨酸。表明山梨酸苯丙氨酸乙酯对食品常见污染菌具有较强的抑菌活性。而山梨酸对酿酒酵母和黑曲霉的最低抑菌浓度分别为4.50mmol/L和4.00mmol/L，比山梨酸苯丙氨酸乙酯的抑菌效果要好。

表4 山梨酸苯丙氨酸乙酯对供试菌的最低抑菌浓度（mmol/L）Table4 Antimicrobial activity of ethyl N-[1-oxo-2，4-hexadien-1-yl]-L-phenylalaninate against the selected microorganisms determined as theminimal inhibitory concentration（MIC，inmmol/L）

2.5 山梨酸苯丙氨酸乙酯对牛奶酸败混合菌的生长抑制作用

实验中，山梨酸苯丙氨酸乙酯和山梨酸的添加量都为2.5mmol/L。由图5可以看出，在pH等于7的中性条件下，空白对照组中牛奶酸败混合菌快速生长繁殖，当时间为12h时，菌液的OD560nm值便达到了0.984。而山梨酸和山梨酸苯丙氨酸乙酯的细菌生长适应期均延长至了24h，抑菌率达到90%以上，表明山梨酸和山梨酸苯丙氨酸乙酯具有明显的抑菌作用。在pH等于5的酸性条件下，山梨酸表现出较好的抑菌效果，其48h内菌液的OD560nm值在0.1以下。山梨酸苯丙氨酸乙酯的抑菌效果则与在中性条件下的抑菌效果相当，24h内可显著抑制细菌的生长。在pH等于9的碱性条件下，山梨酸苯丙氨酸乙酯依然具有较好的抑菌活性，使得牛奶酸败混合菌的适应期延长至36h。但山梨酸在pH等于9的碱性条件下，当时间为18h，抑菌率在10%以下，表明其几乎完全失去了抑菌活性。

综上所述，山梨酸虽然具有较强的抑菌效果，但仅在酸性条件下得以发挥其作用。在中性条件下，山梨酸的抑菌效果则大大降低。而在碱性条件下，山梨酸几乎没有任何抑菌活性，可能是由于反应生成盐后改变了其性质的缘故。山梨酸苯丙氨酸乙酯的抑菌效果受体系pH影响较小，在不同的pH条件下依然可以保持较强的抑菌活性。

3 结论

3.1 以山梨酸、苯丙氨酸和乙醇为原料，通过酰氯反应，可以较高效率地合成山梨酸苯丙氨酸乙酯。合成苯丙氨酸乙酯盐酸盐最佳工艺条件为：反应时间3.5h，反应温度60℃，苯丙氨酸和氯化亚砜的摩尔比1∶3.2，此时收率可达93.8%。

图5 山梨酸苯丙氨酸乙酯对牛奶酸败混合菌的生长抑制作用Fig.5 The growth inhibition effect on themixed bacteria from ranciditymilk of ethyl N-[1-oxo-2，4-hexadien-1-yl]-L-phenylalaninate

3.2 山梨酸苯丙氨酸乙酯对肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和牛奶酸败混合菌的最低抑菌浓度分别为2.50、0.75、2.00、2.50mmol/L，其抑菌效果要优于防腐剂山梨酸。

3.3 山梨酸苯丙氨酸乙酯在不同的pH体系均具有较强的抑菌活性，有望作为新型防腐剂应用于食品、化妆品领域。

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