大豆分离蛋白-磷脂复合乳化体系的制备及pH对其影响的研究

王 欢，冯红霞，张雅娜，王 妍，李 杨，江连洲，王 晶

（东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030）

大豆分离蛋白形成乳化液后，形成的保护层可以防止油滴聚集和乳化状态的破坏，即大豆蛋白乳化稳定性[1-3]。蛋白形成的乳化体系性质除了受蛋白分子本身的性质影响还受各种外界因素的影响[4]。磷脂的疏水的脂肪酸基团朝向空气，亲水的甘油磷酸酯基朝向水面排列，降低水油间的界面张力，从而有利于形成均一稳定的乳化液[5-6]。磷脂中各组分的含量对其乳化性有一定影响[7-9]。

磷脂与蛋白复合，由于磷脂的特殊结构，可以改变蛋白在水中的分散性能，防止结团[10-11]。Comas[12]提出不同存在状态的大豆蛋白质单独存在或与卵磷脂交联；Taha采用不同的变性剂，高压灭菌和极端pH处理，在添加变性蛋白质的氧化油中会形成更多的脂质-蛋白质复合物[13-14]。

近年来，我国豆制品行业不断发展，大豆食品作为健康食品在全球市场的消费趋热。由于大豆蛋白质与磷脂均具有良好的乳化性能，使传统豆制品如豆腐、豆奶、豆浆等在加工中极易形成乳化体系，乳化体系界面特征直接关系到产品口感、货架期、应用等。而在实际生产加工过程中，pH对产品的质量有一定的显著影响。因此，全面探究pH对大豆蛋白-磷脂乳化体系的共建机制的影响，为有效解决传统豆制品加工中产生的“乳化体系调控”瓶颈问题提供理论指导。

本文以大豆分离蛋白、大豆磷脂及葵花油为原料，制备复合乳化体系，经不同pH环境处理下对复合乳化体系的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大豆（东农42） 东北农业大学大豆研究中心；大豆磷脂 KAYON，上海楷洋生物技术有限公司；葵花油 超市购买；电泳Marker 无锡同创生化试剂公司；Tris 无锡同创生化试剂公司；NaHSO3、NaOH、Na2HPO4、邻苯二甲酸氢钾 分析纯。

LW-1600FC紫外可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；荧光正置显微日本Nikon；激光粒度分析仪 BECKMAN COULTER；ES-2030冷冻干燥机 HITACHI4；PHS-3C雷磁pH计 上海精科；均质机 巩义市予华仪器有限责任公司；LGR20-w高速低温离心机 北京京立离心机有限公司；M ini-ProteinⅢ电泳仪 美国伯乐公司。

1.2 实验方法

1.2.1 制备大豆分离蛋白 大豆分离蛋白的传统提取方法为碱提酸沉法[15-16]，主要利用大豆蛋白在高pH的情况下溶解度大，在等电点pH时溶解度最小的特点将其凝聚沉淀。

称取足量的大豆，放入烘箱中烘干55℃干燥30m in；取出烘干后的大豆进行剥皮，用Polymix A10高速粉碎机粉碎，倒出粉碎大豆粉过筛（40目）。把过筛后的大豆粉均分在几个三角瓶中，按1∶3比例加入正己烷，放在磁力搅拌器上搅拌30min。时间到后，将三角瓶中的固液混合物全部倒入大离心筒中，配平，用低速离心机离心（4000×g，15m in）。重复上述的磁力搅拌和离心操作三次以上，除去上层液体将固形物全部倒入大烧杯中，再置于通风橱中使正己烷完全挥发，既得脱脂豆粉备用。取适量脱脂豆粉与蒸馏水按1∶10比例在三角瓶中混合，加入NaOH调节pH至9，然后放在磁力加热搅拌器上加热搅拌50m in（50℃）。搅拌停止后，将三角瓶内的混合物倒入离心筒中，配平，离心15m in（4000×g）。将离心筒中的上清液倒入烧杯中，逐滴加入HCl调至pH4.6，再将混合物离心分离，取沉淀，用NaOH调节pH至7，搅拌40m in，将调节完pH的蛋白均匀置于平皿内，放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，既得成品大豆分离蛋白。

1.2.2 蛋白含量测定 采用凯氏定氮法测蛋白质含量[17]。

1.2.3 凝胶电泳分析 采用SDS-PAGE电泳方法[17-20]。

1.2.4 大豆蛋白-磷脂复合乳化体系的制备 根据国内外研究确定大豆蛋白-磷脂复合乳化体系中蛋白：磷脂（w/w）为10∶1。将一定量的大豆蛋白溶解在pH为7的缓冲液中[12，21]，常温、磁力搅拌1h，加入大豆磷脂，继续搅拌0.5h，将大豆蛋白、磷脂混合液倒入烧杯中，加入一定量的葵花油，在高速均质机的作用下得到大豆蛋白-磷脂复合乳化体系[22]。测定乳化活性指数（EAI）和乳化稳定性（ESI）。

1.2.4.1 大豆蛋白-磷脂复合乳化体系中蛋白浓度的确定 蛋白：磷脂（w/w）为10∶1，均质条件：60s、20000r/m in，油相体积分数：25%，蛋白浓度：1、2、4、6、8、10、12、14、16mg/m L。

1.2.4.2 大豆蛋白-磷脂复合乳化体系中油相体积分数的确定 蛋白：磷脂（w/w）为10∶1，均质条件：60s、20000r/m in，蛋白浓度：10mg/m L，油相体积分数：10%、15%、25%、30%、35%、40%。

1.2.4.3 大豆蛋白-磷脂复合乳化体系中均质时间的确定 蛋白：磷脂（w/w）为10∶1，均质转数：20000r/m in，蛋白浓度：10mg/m L，油相体积分数：25%，均质时间：20、30、40、50、60、120s。

1.2.5 理化因素指标（pH）的选择 制备pH 3～11的缓冲溶液[23]。pH 3～6缓冲液配制：柠檬酸-Na2HPO4（Mollvaine）缓冲液；pH7～9缓冲液配制：三羟甲基甲烷（Tris）-盐酸缓冲液；pH 10缓冲液配制：甘氨酸-NaOH缓冲液；pH11缓冲液配制：磷酸缓冲液。

1.2.6 乳化体系性能指标测定

1.2.6.1 乳化性的测定 将均质后的乳状液立即用0.1%的SDS溶液稀释250倍，在500nm波长的紫外分光光度计测定吸光值计算乳化活性指数（EAI）[12，24-25]，静置30m in后测定吸光值计算乳化稳定性（ESI），公式如下：

式中：N：稀释倍数（250）；C：乳化液形成前蛋白质水溶液中蛋白质浓度（g/m L）；φ：乳化液中油相体积分数；A0：0min时吸光值；A30：30min时吸光值。

1.2.6.2 粒径分析 立即将均质后的乳状液慢慢滴入Malvern激光粒度分析仪的采样装置中测定粒度分布，测定温度25℃[12]。

1.2.6.3 显微镜观察 均质后，立即将乳状液至于载玻片上，盖上盖玻片，放置于荧光正置显微镜下，在100倍目镜条件下观察乳状液的大小。

1.2.7 数据分析 所有实验数据均为“平均值±标准差”，n=3，采用ORIGIN 8.5和SPSS统计分析软件对实验数据进行分析。

2 结果与讨论

2.1 大豆分离蛋白SDS-PAGE电泳分析

根据凯氏定氮方法测得制备的大豆分离蛋白中蛋白含量为85.78%。图1是大豆分离蛋白的SDSPAGE电泳图谱。由图1可知，1号谱带为蛋白Marker，2号谱带为制备的大豆分离蛋白，根据Scion Image扫描分析软件分析得到大豆分离蛋白7S亚基含量约为37.1，11S亚基含量约为60.7。大豆分离蛋白中7S和11S比例约为2∶3。

图1 大豆分离蛋白的SDS-PAGE图谱Fig.1 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of SPI fractions

2.2 大豆蛋白-磷脂复合乳化体系的制备

2.2.1 蛋白浓度的确定 图2、图3分别为蛋白浓度对大豆蛋白-磷脂复合乳化体系的乳化活性指数和乳化稳定性的影响。如图2、图3可见，随着蛋白浓度的增加，复合乳化体系的乳化活性指数和稳定性均增强，但当蛋白浓度达到10mg/m L时，幅度趋于平缓，蛋白含量逐渐增多，磷脂的亲水基团-甘油磷酸酯基朝向水面排列，可以降低水油间的界面张力，提高了复合体系的乳化性，当蛋白达到一定浓度后蛋白和磷脂的混合达到了饱和状态，乳化性能趋于平缓，在高浓度蛋白体系下，絮凝粒子之间间距很小，会通过氢键和胶体作用等方式相互作用。所以蛋白浓度选择10mg/m L。

图2 蛋白浓度对复合乳化体系EAI的影响Fig.2 The effectof protein concentration on the EAIof complex emulsion system

图3 蛋白浓度对复合乳化体系ESI的影响Fig.3 The effect of protein concentration on the ESIof complex emulsion system

图4 油相体积分数对复合乳化体系EAI的影响Fig.4 The effectof the oil phase volume fraction on the EAIof complex emulsion system

2.2.2 油相体积分数的确定 图4、图5为油相体积分数对大豆蛋白-磷脂复合乳化体系的乳化活性指数和乳化稳定性的影响。如图4、图5可见，随着油相体积的增加，复合乳化体系的乳化活性指数和乳化稳定性增强，但当蛋白浓度达到25%时，乳化活性指数趋于平缓，在40%时有所下降；稳定性幅度趋于平缓，在35%处略有降低，40%时又有所升高；是由于随着油相体积的增多，蛋白-磷脂复合乳化体系中蛋白和磷脂分子中亲油基团更紧密的连接油相增加乳化体系的稳定性。所以油相体积选择25%。

图5 油相体积分数对复合乳化体系ESI的影响Fig.5 The effectof the oil phase volume fraction on the EAIof complex emulsion system

2.2.3 均质时间的确定 图6、图7分别为均质时间对蛋白-磷脂复合乳化体系乳化活性指数和乳化稳定性的影响。从图6、图7中可以看出，随着均质时间的延长乳化活性指数和乳化稳定性均增强，当达到30s后乳化稳定性略有变化但趋于稳定，和Comas等[12]研究结果相似。所以均质时间选择30s。

图6 均质时间对复合乳化体系的EAI的影响Fig.6 The effectof homogeneous time on the EAIof complex emulsion system

图7 均质时间对复合乳化体系的ESI的影响Fig.7 The effect of homogeneous time on the ESIof complex emulsion system

2.3 pH对乳化活性指数及稳定性的影响

图8、图9为pH对蛋白-磷脂复合乳化体系的乳化活性和乳化稳定性的影响。从图8、图9可见，在pH小于7时，乳化活性及乳化稳定性均较低，在pH4时出现最低值；当pH大于7时，随着pH的增大，乳化活性及稳定性均呈现缓慢增长趋势，在pH11时又有小幅度的降低。在pH 4左右的乳化活性及稳定性较低是因为此范围在大豆分离蛋白的等电点附近，蛋白沉降聚集，电荷几乎为0，亲水和亲油基团几乎完全不能吸附水相和油相，此复合乳化体系中磷脂受pH影响较小，但磷脂含量较少所以不能抵制等电点对复合乳化体系的显著影响。当pH在中性及弱碱性环境下，乳化活性及稳定性较好，在pH 11时，碱性较强，强碱环境开始对蛋白及磷脂结构造成影响，故有下降趋势。

图8 pH对乳化活性指数（EAI）的影响Fig.8 The effectof different pH on the EAIof Soy protein-phospholipid complex emulsion system

图9 pH对乳化稳定性（ESI）的影响Fig.9 The ESIof Soy protein-phospholipid complex emulsion system with different pH

2.4 pH对乳化体系的粒径分析影响剂显微镜观察

图10 不同pH条件下大豆蛋白-磷脂复合乳化体系的粒径分布Fig.1 0 The effectofdifferent pH on the particle size distribution of Soy protein-phospholipid complex emulsion system

图10为不同pH条件下大豆蛋白-磷脂复合乳化体系的粒径分布，由图8、图9可知pH对大豆蛋白-磷脂复合乳化体系乳化性的影响，而粒径分布是评价乳化性的另一个指标，乳化活性越好，粒径就越小。随着pH的增大，粒径曲线逐渐向左迁移，从图10可见，在pH 3～6范围内粒径大小在100～200μm内较多，且pH 4时最多，在pH 7时粒径大小多集中在40～50μm范围内，而pH8～11范围内时，粒径均分布较小，且出现部分重叠现象，这些都与图8、图9的结论相似。

图11为不同pH条件下大豆蛋白-磷脂复合乳化体系的显微镜观察，由图11可见，pH 3～6时乳化体系颗粒较大，小圆珠为油相，流动相为水相，蛋白和磷脂吸附在油水界面上，pH 7时的颗粒小于pH 3～6时的颗粒，且大于pH 8，pH 9～10颗粒最小，pH 11的颗粒略大于pH 9～10的。这些均与图10的粒径分布相符合。

图11 不同pH条件下大豆蛋白-磷脂复合乳化体系的显微镜观察Fig.1 1 Themicroscope of Soy protein-phospholipid complex emulsion system with different pH

综上，乳化活性与乳化稳定性均在pH小于7时较低，尤其是在pH 4左右最低，主要原因是此范围处于大豆分离蛋白的等电点附近，电荷为0；pH大于7时，随着pH的增加，乳化活性及乳化稳定性呈现缓慢增加趋势，通过粒径分布图及显微镜观察也同时对上述现象进行了印证。

3 结论

本实验中大豆分离蛋白，与大豆磷脂、葵花油在均质机作用下制备复合乳化体系，以乳化活性指数和乳化稳定性为指标经单因素实验确定复合乳化体系制备参数：大豆分离蛋白∶大豆磷脂（w/w）=10∶1，水相∶油相（v/v）=3∶1，大豆分离蛋白含量为10mg/m L，均质时间30s，均质速度20000r/m in。乳化活性、乳化稳定性、粒径分析及显微镜观察发现，大豆蛋白-磷脂复合乳化体系在pH≥7环境下，乳化体系较稳定，这种环境下的豆制品性能较好，为豆制品生产加工提供理论依据。

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