MBTH 法检测木聚糖酶活性

■徐丽 王冠 丁皓 程瑛

(武汉新华扬生物股份有限公司，湖北武汉 430074)

木聚糖是植物半纤维素的主要成分，是自然界中仅次于纤维素的可再生资源，主要成分为D-木糖。虽然木聚糖是一类广泛存在于植物体内的半纤维素，但是，由于木聚糖在动物消化道内不能被消化吸收，并且阻碍其它营养成分的消化利用，具有很强的抗营养特性，因而限制了许多饲料的应用。木聚糖酶是一类重要的木糖苷键水解酶酶系，可将木聚糖逐次降解为低聚木糖及木糖，从而消除木聚糖的抗营养作用，提高动物对饲料的利用率。目前检测木聚糖酶最常用的方法为DNS法，但此法灵敏度低，难以满足饲料中微量添加量的检测。3-甲基-2-苯并噻唑酮腙（MBTH）法主要用来测定醛的含量，由于木糖的半缩醛结构具有一定的还原性，MBTH首先与还原糖反应生成嗪，过量的MBTH被Fe3+氧化成阳离子，再与嗪反应生成青蓝色化合物，在一定范围内，还原糖的量和反应液的颜色强度呈正比例关系。本文根据这一原理检测木聚糖酶的酶活力，旨在验证该方法的可行性。

1 材料与方法

1.1 试剂与设备

木糖（sigma）、木聚糖（sigma）、木聚糖酶、3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)、二硫苏糖醇（DTT）、硫酸铁铵、氨基磺酸、乙酸、乙酸钠、氢氧化钠试剂等。

紫外-可见分光光度计（Unico UV2800）、水浴摇床（常州国华）、漩涡混合器、电子天平（精确至0.000 1 g）、带搅拌的恒温水浴锅（HH-4，常州国华）、移液器、秒表设备等。

1.2 样品

木聚糖酶及饲料样品均采购于市场。

1.3 溶液及其配制

50 mM pH值5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液：称取三水乙酸钠5.785 g，加入冰乙酸0.425 ml，加水溶解，定容至1 000 ml。测定溶液pH值，如果偏离5.50，再用乙酸或乙酸钠溶液调节至5.50。

MBTH显色液：3 mg/ml的MBTH溶液和1 mg/ml的DTT溶液等量混合即得，现用现配，1 d内有效。

硫酸铁铵试剂：准确称量5.000 g硫酸铁铵[FeNH4(SO4)2·12H2O]和5.000 g氨基磺酸，溶解，转移至1 000 ml容量瓶中，加入36%～38%的浓盐酸41.75 ml，溶解，定容，充分混匀，转移至棕色瓶中，于4℃冰箱贮藏待用。

1 mg/ml木糖标准溶液：精确称取干燥至恒质量的木糖0.100 1 g，用缓冲液定容至 100 ml，得 1 mg/ml的木糖溶液。

1.4 制作标准曲线

分别吸取木糖标准溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 ml和 2.8 ml，用缓冲液定容至 100 ml，配制成浓度为4、8、12、16、20、24、28 μg/ml木糖溶液。

分别取上述各浓度木糖溶液500 μl（3组平行样），加入到500 μl 0.5 M的NaOH溶液中，再分别加入MBTH试剂500 μl，充分混匀，80℃水浴加热15 min后，迅速趁热加入硫酸铁铵试剂1 ml，室温冷却后在650 nm处测定吸光度值。以相应缓冲溶液代替木糖溶液制成空白样。

以木糖浓度为Y轴，吸光值为X轴，得出标准曲线。

1.5 反应用酶液的制备

1.5.1 饲料中木聚糖酶反应样品的预处理

除按GB/T 14699.1的规定进行采样外，对于用喷涂方式添加木聚糖酶的颗粒配合饲料，应开包将颗粒及粉化的料混匀后，按四分法缩分至200 g，并粉碎通过0.45 mm标准筛，混匀后装入密封容器内备用。

1.5.2 固体样品反应用酶液制备

称取0.5 g样品（颗粒及粉状样品均按1.5.1进行预处理）于150 ml锥形瓶中，精确至0.000 1 g，加入50 ml缓冲液，在回旋式振荡器上提取30 min。提取后的试样在离心机上以12 000 r/min离心10 min,取上清液待测。

1.5.3 液体样品的反应用酶液制备

液体样品直接用乙酸-乙酸钠缓冲液进行稀释，定容。

1.6 木聚糖酶活力测定

将经预处理的且37℃预热过的0.5 ml酶液和0.5 ml底物溶液（0.8 mg/ml）于试管中混合好后开始计时，于37℃水浴反应30 min，加入1 ml 0.5 M的NaOH溶液，充分混合以终止反应，再分别加入MBTH试剂1 ml，充分混匀，80℃水浴加热15 min后，迅速趁热加入硫酸铁铵试剂2 ml，室温冷却后在650 nm处测定吸光度值，对照标准曲线计算木糖的量。同时以缓冲溶液代替酶溶液检测以作为空白对照。

1.7 回收率试验

精确添加一定量木聚糖酶至已知酶活饲料中，按1.6检测酶活，计算回收率。

1.8 计算公式

式中：X——木聚糖酶活性（U/g）；

AE——酶反应液吸光值；

AB——空白对照吸光值；

K——标准曲线的斜率；

C——标准曲线的截距；

n——样品的稀释倍数；

m——样品质量（g）；

t——反应时间（min）；

M——木糖的摩尔质量，为150.13 g/mol。

2 结果与分析

2.1 MBTH法测木糖标准曲线

MBTH法测木糖标准曲线为y=30.157x-1.037 7,R2=0.999 2（1 cm比色皿）；y=56.265 3x+0.051 6，R2=0.999 5（0.5 cm比色皿）。

2.2 MBTH法检测木聚糖酶酶活

取不同公司的酶制剂样品，采用MBTH法检测其中木聚糖酶的活性，结果见表1。

表1 MBTH法检测木聚糖酶酶活（1 cm比色皿）

如表1所示，除样品6外，其它样品采用MB⁃TH法测得的木聚糖酶活性均为标示酶活（国标法）的1/22左右，这可能是由于国标法检测的指标是还原性末端，无论多糖还是单糖，只要具有还原性末端均能发生显色反应，而MBTH则只是检测木糖或者寡糖的含量，因而，MBTH法测得的活性就比国标法要低。但是样品6的木聚糖酶采用MBTH法测得的木聚糖酶活性仅有国标法的1/46左右，说明该酶的酶解反应产物主要是多糖，而木糖和寡糖所占的比例极小，饲料酶需要将多糖分解为单糖和寡糖才有意义，也就是说样品6的木聚糖酶的实际应用效果较差，同样活性的情况下几乎只有其它样品中木聚糖酶效果的50%左右。这可能是由于发酵菌种的不同造成的。综上所述，可以使用MBTH法检测木聚糖酶的活性。

2.3 MBTH法检测饲料中木聚糖酶酶活（见表2）

表2 MBTH法检测饲料中木聚糖酶酶活（1 cm比色皿）

如表2所示，对饲料中的木聚糖酶采用MBTH法进行检测，结果发现，与标示添加量的比例在18左右，与单纯检测木聚糖酶活性的结果（22倍）有些出入。为了验证该方法的准确性，做了如下的方法学验证（见表3）。

表3 MBTH方法学验证试验（1 cm比色皿）

MBTH法的准确度为103.13%，符合饲料中酶制剂不高于15%的检测误差要求，因此，MBTH法检测饲料中酶制剂的结果是准确可靠的。

2.4 MBTH法检测木聚糖酶酶活（0.5 cm比色皿）

由于检测饲料中木聚糖酶时MBTH法的空白吸光值过高，严重干扰了样品的检测，导致实际应用效果不理想；参考专利的办法，将1 cm的比色皿改为0.5 cm的，从而减少其空白吸光值，以减小空白对样品检测的干扰。

取不同公司的木聚糖酶样品，使用0.5 cm比色皿重做MBTH法的标准曲线，采用MBTH法检测木聚糖酶的酶活，结果见表4。

表4 MBTH法检测木聚糖酶酶活（0.5 cm比色皿）

更换比色皿后，两种方法测得的结果间比例有所不同，使用1 cm比色皿是22倍左右，而使用0.5 cm比色皿则是9倍左右。

再取饲料样品，检测其中的木聚糖酶酶活，见表5。

表5 MBTH法检测饲料中木聚糖酶酶活（0.5 cm比色皿）

结果发现，MBTH法检测饲料中木聚糖酶的结果较稳定，和标示酶活的比例仍是1/9左右。采用0.5 cm比色皿后，检测结果较稳定，与标示酶活相比木聚糖酶和饲料中木聚糖酶的比例都是1/9左右，但这样做牺牲了MBTH的检测灵敏度，因为空白吸光值降低的同时样品吸光值也降低了。仍取表5中样品1和样品2，采用MBTH法检测，并在正常检测的基础上增大取样量，以验证其灵敏度(见表6)。

结果发现，正常检测的情况下，样品1的空白值是0.515，样品吸光值为0.252；当取样量加倍时，空白及样品吸光值都升高了，但空白吸光值增幅更大，从而干扰检测结果，使得检测结果偏低。样品2也得到同样的结果，而且吸光值偏高，很容易超出线性范围。

3 讨论

MBTH法可用来检测醛类物质，也会与半缩醛结构的单糖、寡糖发生反应，结合本试验结果发现，MBTH法确实可检测木聚糖酶的活性，并且其酶活可在一定程度上反映其实际应用效果。但是应用到饲料中木聚糖酶的检测时还存在一定弊端，由于MBTH还可与饲料中的某些还原性物质反应，样品空白对照受到严重干扰，使得检测值偏低，检测限下降。即使采用0.5 cm比色皿对该法进行改进，也不能完全消除这种干扰，因此，此法虽可用，但若能更好地降低空白对照吸光值又不影响样品吸光值，才能体现出该法的优越性。

（参考文献若干篇，刊略，需者可函索）