枯草芽孢杆菌对青年母猪玉米赤霉烯酮中毒症的缓解作用

■ 马珊珊 石慧芹马秋刚 计 成 段国香 张建云 郑文革

（1.中国农业大学动物科技学院动物营养国家重点实验室，北京 100193；2.河南亿万中元生物技术有限公司，河南郑州 451191）

玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）又称F-2毒素，是由镰孢菌属真菌产生的非类固醇类真菌毒素，可与体内雌激素受体相结合，产生雌激素效应[1-2]。高温低湿环境下，霉变的玉米、高粱、小麦等谷类作物易产生ZEN，作为饲料原料的谷物被动物采食后，经代谢可沉积于肉、蛋、奶等动物产品中，严重威胁动物体健康和食品安全。猪对玉米赤霉烯酮的雌激素效应最为敏感，典型临床症状为阴户肿大、阴道和直肠脱垂以及乳腺增大，引起母猪的不孕、流产和假发情等繁殖障碍[3-5]。此外，ZEN还具有肝毒性、免疫毒性、细胞毒性和遗传毒性，对肿瘤的发生也有一定影响[2，6]。

全世界范围内的谷物和饲料都受到霉菌毒素的威胁，严重威胁动物的生产性能和食品安全，每年给饲料工业和畜牧业造成巨大的经济损失[7]。中国作为一个农业大国，寻求一种安全、有效的霉菌毒素脱毒方案尤为重要。霉菌毒素传统的物理和化学脱毒方法，因其效果不稳定、营养成分损失大、改变饲料适口性等缺陷限制了在实际生产中的广泛应用[8]。而微生物及生物酶降解，以其降解效率高、特异性强、对饲料和环境无污染等优势，受到研究者们的广泛关注[9-10]。本课题组分离得到1株具有ZEN降解活性的细菌，其发酵液对ZEN降解率达到83.04%，经16S rDNA鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），根据其功能特性将该菌命名为霉立解01G菌。由于枯草芽孢杆菌的商品制剂是经国际公认可直接饲喂动物的安全级(GRAS)微生物制品，应用于开发动物饲料酶制剂的前景广阔。本试验对筛选得到的霉立解01G菌进行降解活性组分确定及组分性质研究，同时将霉立解01G菌进行工业化发酵、干燥，生产ZEN生物酶降解剂——霉立解，将其添加到ZEN自然霉变的青年母猪日粮中，观察猪的外阴变化情况，以及霉立解01G菌对猪ZEN中毒症状的缓解作用，为实际生产中霉立解01G菌的应用及ZEN污染饲料的控制提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

菌株筛选：从动物食糜、霉变粮食和土壤等样品中分离得到的细菌，及实验室保藏的其他益生菌株。

霉立解01G菌：本课题组在鸡肠道食糜中分离得到，经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其发酵液对ZEN的降解率可达到83.04%。该株菌已经保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.4297。同时，该株菌已被申请国家发明专利并获授权(专利号：ZL 201010620651.2)。

1.2 ZEN污染饲料原料来源

ZEN污染日粮：在各地饲料原料供给厂采集霉变玉米样本，选取一种仅被ZEN污染的样本，替代正常日粮中的玉米。霉变玉米中ZEN检测含量为486 μg/kg，黄曲霉毒素、呕吐毒素、赭曲霉毒素均为未检出。

1.3 霉立解的生产

由霉立解01G菌进行工业化发酵、干燥生产得到，活菌数为 1×109CFU/g（由河南亿万中元生物技术有限公司生产）。

1.4 主要试剂及仪器

ZEN标准品（Sigma公司）；LB液体培养基（1 000 ml）：胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、氯化钠10 g，pH值7.0～7.2（固体培养基添加16 g琼脂）。

高效液相色谱仪(HPLC，岛津LC-20AT)、恒温振荡培养箱、超净工作台、恒温水浴锅、冷冻离心机、细胞破碎仪等。

1.5 试验设计与试验日粮

试验分为3个处理，试验设计见表1，对照组青年母猪饲喂正常玉米型日粮，试验组Ⅰ青年母猪饲喂霉变玉米型日粮（ZEN含量为238 μg/kg），试验组Ⅱ青年母猪饲喂霉变玉米型日粮（ZEN含量为240 μg/kg）+霉立解（2 kg/t）。全部日粮于试验正式开始前1周一次性配制，在试验前取样，分析日粮中的养分含量及毒素水平。试验日粮为玉米-杂粕型基础日粮，其营养水平参照NRC（1998）推荐标准配制，基础日粮配方及营养水平见表2。

表1 试验设计

表2 基础日粮组成及营养水平

1.6 试验动物与管理

选择18头平均体重为(36.64±1.52)kg的健康杜×长×大三元杂交青年母猪，随机分到3个处理组，每个处理6个重复，每个重复1头猪，各处理间初始体重差异不显著（P＞0.05）。试验开始前全猪舍清扫并消毒，试验期间每天清粪后消毒，单笼饲养，猪只自由采食和饮水。试验期为24 d，试验在河南亿万中元生物技术有限公司猪场进行。

1.7 试验方法

1.7.1 ZEN降解菌的筛选及降解活性测定

降解ZEN的益生菌筛选，按照Gao等[11]的方法，每个样品取1 g分别接种到10 ml LB培养基中，在37℃、200 r/min条件下摇瓶培养24 h后，80℃水浴加热15 min，将加热后的发酵液在LB固体培养基上划线，37℃培养24 h。然后将不同形态的菌落接种到50 ml LB液体培养基中，在37℃、200 r/min摇瓶培养24 h。取发酵液900 μl加入100 μl（5 mg/kg）ZEN标准品，在37℃黑暗的培养箱中反应72 h。以等量的LB培养基加ZEN为对照组，用高效液相色谱（HPLC）的方法对ZEN的降解率进行测定。

1.7.2 霉立解01G菌降解ZEN活性组分的确定

将霉立解01G菌接种到50 ml/250 ml装液量的LB培养基中，在37℃、200 r/min条件下摇瓶培养24 h，得到霉立解01G发酵液。取5 ml发酵液，4℃离心20 min(8 000 r/min)，分离上清液与菌体，上清液于4℃备用；离心后的菌体用蒸馏水洗涤，再离心，取菌体加入5 ml蒸馏水制得菌悬液，备用；以同样的方法再制备一份菌体，对菌体使用细胞破碎仪进行破碎，然后溶于5 ml蒸馏水制成胞内液备用。

1.7.3 霉立解01G菌发酵液活性组分性质的研究

对霉立解01G菌发酵上清液分别进行热处理（100℃加热10 min）和蛋白酶K处理（0.01 g/ml蛋白酶K与发酵上清液反应2 h）。按上述方法进行降解反应试验，研究降解活性物质的性质。

1.7.4 日粮养分和毒素水平检测

日粮中常规养分含量的测定按照张丽英(2003)的方法进行。

参照GB/T 23504—2009《食品中玉米赤霉烯酮的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法》的ZEN测定方法，并根据试验情况进行调整。利用免疫亲和柱净化，提取日粮中ZEN、黄曲霉毒素、呕吐毒素和赭曲霉毒素，最后利用HPLC法对其含量定量分析。其中对ZEN、黄曲霉毒素、呕吐毒素和赭曲霉毒素的最低检测限为 1 μg/kg、0.1 μg/kg、0.1 mg/kg 和1 μg/kg。

1.7.5 阴户测量与计算

试验开始后每天观察并记录猪只阴户肿胀情况，用游标卡尺测量阴户长（a）、宽（b），并计算阴户表面积(S)。计算公式S=（π×a×b）/4，比较各组猪只的阴户增大及恢复效果。

1.8 数据统计及分析

用SAS 8.1软件的一般线性模型（General linear model，GLM）程序对试验数据进行方差分析，以P＜0.05为显著水平，方差分析显著者则进行Duncan's法多重比较，结果用“平均值±标准误”表示。

2 结果分析

2.1 筛选到的降解ZEN的菌

本试验从动物食糜、霉变粮食和土壤等样品中分离得到的细菌及实验室保藏的益生菌株中，筛选得到一株能够降解ZEN的细菌，其发酵液对ZEN降解率达到83.04%。经过16S rDNA鉴定为枯草芽孢杆菌，并命名为霉立解01G菌。

2.2 霉立解01G菌降解ZEN活性组分的确定（见图1）

图1 霉立解01G菌不同组分对ZEN的降解率

由图1可知，霉立解01G菌发酵液和上清液降解活性显著高于菌悬液和胞内液，其降解率分别达到83.04%和75.60%，而菌悬液和胞内液的降解率仅为15.06%和26.11%。因此，初步认为霉立解01G菌降解ZEN的活性物质主要存在于发酵后的上清液中，是一种胞外分泌物质。

2.3 霉立解01G菌发酵液活性组分性质的研究（见图2）

图2 霉立解01G菌上清液经热处理和蛋白酶K处理后对ZEN的降解率

图2结果显示，霉立解01G菌发酵后的上清液经热处理和蛋白酶K处理后其对ZEN的降解率显著降低，发酵后的上清液经热处理后对ZEN的降解率降低至23.06%，经蛋白酶K处理后降低至18.24%。因此，可初步判断霉立解01G菌对ZEN的降解活性物质是一种细胞所产胞外酶。

2.4 霉立解01G菌对饲喂ZEN污染日粮青年母猪阴户面积的影响（见表3、表4）

由表3可知，试验0～3 d各组间青年母猪阴户面积均无显著差异(P＞0.05)，未出现红肿现象。试验3～10 d，试验组Ⅰ和试验组Ⅱ猪阴户面积大小水平相同，均高于对照组，并且出现红肿症状。试验10～17 d，试验组Ⅱ的阴户面积逐渐恢复至对照组水平，红肿症状逐渐消失，而试验组Ⅰ阴户面积仍然大于对照组且红肿现象未消失。试验17～24 d，试验组Ⅰ阴户面积均高于对照组和试验组Ⅱ，且红肿现象未消失，而试验组Ⅱ与对照组水平相同。

表3 霉立解对饲喂ZEN污染日粮青年母猪阴户面积的影响(mm2)

表4 霉立解对饲喂ZEN污染日粮青年母猪不同时期外阴面积的增加量变化(mm2)

由表4可知，在0～10 d试验组Ⅰ和试验组Ⅱ猪阴户面积的增加量明显大于对照组；而试验第10～17 d试验组Ⅱ增加量为负值且与对照组和试验组Ⅰ相比差异显著，说明试验组Ⅱ由于霉立解01G菌的作用使外阴肿大现象显著地改善。从试验0～24 d外阴的总增加量变化可以看出试验组Ⅰ有高于对照组的趋势，而试验组Ⅱ增加量低于试验组Ⅰ。

3 讨论

ZEN作为一种雌激素类真菌毒素，其作用效应集中表现在对外周生殖器官的影响，可引起猪的雌激素过多症，典型的临床症状为阴户湿肿、阴道和直肠脱垂以及乳腺增大，引起母猪的不孕、流产和假发情等繁殖障碍[12-13]。Teixeira等研究发现，日粮中添加0.75 mg/kg ZEN饲喂(8.55±0.60)kg雌性仔猪，7 d时即出现阴户红肿，至试验第21 d，其阴户面积、生殖道增重显著高于对照组猪，而其子宫内膜腺体和子宫黏膜上皮细胞高度均显著高于未添加毒素组[12]。Andretta等报道，在日粮中添加2 mg/kg ZEN饲喂断奶雌性仔猪，可显著增加生殖道长度和重量，并且其阴户体积约为对照组的8.2倍，结果表明，ZEN及其代谢产物会产生类雌激素效应[13]。研究发现，日粮中添加 1.1、2.0、3.2 mg/kg ZEN，断奶母猪阴户出现红肿，且ZEN浓度越高，阴户面积越大，面积增加越快，其长宽高和面积水平均显著高于对照组[14]。

众所周知，枯草芽孢杆菌是一类好氧生长、可形成芽孢的革兰氏阳性菌，对人畜无毒无害、不污染环境，而且还具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力，能分泌多种抗菌物质和酶，是国际公认的可在饲料中直接使用的微生物菌株。霉立解01G菌是本课题组从鸡肠道食糜中筛选得到的枯草芽孢杆菌，进一步的试验证明，该菌株对ZEN的降解活性组分主要存在于发酵上清液中，菌悬液和胞内液活性较低。同时，在上清液经加热和蛋白酶K处理后，其ZEN降解活性显著地降低，初步认为霉立解01G菌对ZEN降解活性物质是一种细胞产生的胞外酶。

本试验除研究了霉立解01G菌在体外对ZEN的降解作用之外，同时研究了低浓度ZEN污染的自然霉变日粮对青年母猪的外阴大小影响及霉立解在ZEN污染日粮中的应用效果。试验结果发现，在试验第10 d时，能观察到试验组Ⅰ和试验组Ⅱ由于ZEN的作用，猪外阴出现明显红肿现象；在试验17 d时，由于霉立解01G菌的作用，试验组Ⅱ猪外阴红肿症状有减轻的趋势；在试验24 d时，试验组Ⅱ与对照组外阴大小水平基本相同，而试验组Ⅰ外阴仍有红肿症状且明显大于试验组Ⅱ与对照组，说明日粮ZEN含量在240 μg/kg时，就可使青年母猪出现不同程度的ZEN中毒现象，主要表现为外阴红肿；而在其日粮中添加霉立解01G菌可在一定程度上缓解或者减轻这种症状；且该菌发挥作用效果需要至少1周的时间，主要原因是，菌在动物消化道定植需要一定的适应时间，当菌适应动物肠道环境后就可大量生长繁殖、分泌活性物质，发挥其作用效果。因此，霉立解01G菌在实际生产中具有良好的开发前景和应用价值。

4 结论

课题组筛选得到的枯草芽孢杆菌(霉立解01G菌)对ZEN具有较高的降解活性；体外降解试验初步证明，降解活性物质是该菌分泌的一种胞外酶。同时，动物试验证明，日粮中含有240 μg/kg的ZEN可导致青年母猪阴户肿胀，在ZEN霉变日粮中添加霉立解01G菌可以显著缓解这种中毒症状。