microRNA与肿瘤细胞周期的关系及其研究方法进展

周珏宇，石 嵘，郑文岭，马文丽

(南方医科大学基因工程研究所，广东广州510515)

细胞周期调控网络的异常与肿瘤的发生发展密切相关，细胞周期蛋白(cyclin)、细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase，Cdk)的异常表达、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(cyclin-dependent kinase inhibitor，CKI)的缺失、以及检测点的异常等都将使细胞周期发生紊乱，细胞增殖失控，导致癌变。微小RNA(microRNAs，miRNAs)是近年来揭示出的一类长度约为21～25个核苷酸的非编码小分子RNA(non-coding small RNA)，它们通过与靶基因mRNA的3'非编码区(untranslated region，UTR)互补结合，在转录后水平上调控靶基因的表达或抑制靶蛋白的翻译。大量证据表明，miRNAs可通过调控其靶基因参与的信号通路，影响肿瘤的发生发展，发挥着类似于癌基因或抑癌基因的功能［1－2］。而某些miRNAs与细胞周期调控有关，它们可以通过靶向 E2F、Cdks、cyclins、CKI等促进或阻滞细胞周期的关键调节因子，进而调控细胞周期，并且这种由miRNAs介导的细胞周期调控方式与恶性肿瘤的发生发展密切相关［3－5］。因此，阐明 miRNAs在细胞周期调控网络中所扮演的功能角色，尤其是其在人类肿瘤发生发展过程中的作用机制是一个值得深入研究的方向［6］。

1 细胞周期与肿瘤

细胞周期是一个由多种蛋白因子协同参与的复杂而精细的过程，这些蛋白在细胞内组成了最基本的调控网络，负责细胞周期的转变和检测点的完成。目前已经发现的与细胞周期调控有关的分子主要包括cyclins、Cdks、CKI，以及抑癌基因编码蛋白P53和pRb等。其中，cyclin和Cdk在细胞周期调控中起核心作用，cyclin是其对应的cyclin-Cdk复合体的调节亚基，其时相性表达是细胞周期调控的关键。这些蛋白在细胞周期运行过程中又依次受到诸多蛋白质(如 P53、P21、P16、CDC25 等)的调控。而 cyclin-Cdk复合物的下游底物又包括pRb和E2F等。此外，细胞内还存在着其他一些调控点(如限制点或检测点)来确保细胞周期的正常运行。

细胞周期紊乱是肿瘤最主要的发生机制，在细胞周期的整个调控网络中，各类分子的异常都有可能引起肿瘤。为了阐明肿瘤细胞周期调控的具体机制，科学家们从不同的角度对细胞周期与癌基因、抑癌基因、生长因子以及细胞增殖分化的关系进行研究，以寻找控制细胞周期的神奇“开关”，并从中筛选得到了一些具有细胞周期依赖性的重要基因［7－9］。上述研究不仅有助于发现更多参与肿瘤细胞周期调控的靶标分子，从细胞周期调控水平上阐明肿瘤的发病机制，而且为肿瘤的临床诊断和治疗提供了重要的线索和依据。

2 miRNAs与肿瘤细胞周期调控

随着分子生物学技术的发展和大量miRNA的发现，这类小RNA在生物体内的重要意义才被科学界广为接受，并成为近10年来的研究热点。据预测，人体内大约有1 000多种miRNA分子，占人类基因总数的1%左右。但它们不是由基因直接转录产生的，而是由RNA聚合酶Ⅱ首先从其编码基因转录出较长的初级转录本(pri-miRNA)，然后在核内由RNaseⅢ家族的Drosha和DGCR8形成的蛋白复合体剪切成长度约为70 nt、带发卡状结构的miRNA前体(pre-miRNA)［10］，并由 Exportin-5/Ran-GTP 转运至细胞质［11］，最后在胞质内由RNaseⅢ家族的另一成员Dicer剪切加工成长度约为22个碱基的成熟miRNA［12］，进 一步 形 成 RNA 诱 导 沉 默 复 合 物(RNA-induced silencing complex，RISC)，结合到靶基因mRNA的3'UTR，从而调控靶基因的表达。

miRNA作为生物体内一类重要的基因表达调控分子，每个miRNA可以调节数百个靶基因，而不同的miRNA分子也可以协同调控同一mRNA分子。miRNA与其靶标分子共同组成了一个复杂的调控网络，控制细胞内多种重要的生命活动［13］。这类小分子RNA被誉为是“生物学中的暗物质，存在于我们周围却几乎逃脱了所有的视线”，它们的发现是对中心法则中RNA次要的中介角色的重要补充，必将促使生物学家重新思考细胞遗传调控及其发育等方面的问题。尽管对miRNA的研究还处于起步阶段，但是据推测miRNAs在真核生物体内对基因表达的调控作用可能和转录因子一样重要，它们可能代表了一种新的层次上的基因表达调控方式。正因为在生长发育、细胞增殖、分化、凋亡、以及肿瘤等疾病发生中的重要作用，miRNAs领域的研究备受关注。

“癌microRNAs”(Oncomirs)这一崭新概念的提出开辟了将miRNAs应用于肿瘤学相关研究的新篇章［14］。越来越多的证据表明，miRNAs在肿瘤的发生发展过程中发挥癌基因或抑癌基因的作用［1，15］。而某些具有抑癌基因或癌基因功能的miRNAs分子可以通过直接靶向 E2F、Cdks、cyclins、CKI等促进或阻滞细胞周期的关键调节因子，进而调控经典的细胞周期信号通路。研究发现，通常具有癌基因功能的 miRNAs 分 子 (如 miR-106-25［16］、miR-27a［17］、miR-221/222［18－19］、miR-17-92［20－21］等)在细胞内表达升高可能通过促进G1/S期的转变，加速细胞周期进程;而具有抑癌基因功能的miRNAs分子(如let-7 family［22］、miR-15/16［23－24］、miR-34 family［25－26］、miR-124/137［27－28］、miR-107［29］、miR-19a［30］等)在细胞内的过表达，则可能诱导细胞发生G0/G1期阻滞，延缓细胞周期进程。此外，某些miRNAs还能与细胞周期调控相关的重要转录因子(如c-Myc、E2F、P53等)协同发挥作用，增强转录因子作用的同时又能抑制促增殖的细胞周期蛋白的过度表达［6］。这些研究充分提示，miRNAs亦是细胞周期调控网络的重要组成部分之一。因此，深入探讨那些受到miRNAs调控的细胞内信号通路，不仅诠释了一个新的研究领域，而且有助于加深我们对经典的细胞周期调控机制的认识和理解，同时也将为揭示miRNA的异常表达与肿瘤细胞周期紊乱的关系提供崭新的思路。

3 miRNA的研究策略

相对于数量庞大的miRNA来说，已知功能的miRNA还相对较少。随着研究方法不断发展和某些高通量的新技术的应用，为探索miRNA世界的奥秘提供更多的选择和帮助。

3.1 miRNA的鉴定

目前主要采用生物信息学方法和直接克隆的方法。miRNA克隆所依赖的结构特征是其特异的5'端磷酸基团与3'末端羟基基团，以T4 RNA连接酶在分子末端加上连接子，再利用RT-PCR方法扩增获得目的片段，克隆到合适的载体中，测序验证。所得到的小分子RNA需要生物信息学方法与分子生物学方法确认，进而注册到miRNA数据库［31］。

3.2 miRNA表达水平的检测

目前研究miRNA表达的方法主要包括Northern blotting、实时定量PCR、RNA酶保护分析(ribonuclease protection assay，RPA)、磁珠流式检测(bead-based flow cytometric assay)、原位杂交(in situ hybridistation)、高通量的 miRNA表达谱芯片(miRNA microarray)、miRNA深度测序(miRNA deep sequencing)等。

Northern杂交:类似于经典的mRNA检测方法，但是过程相对烦琐，且耗时费力，对RNase污染非常敏感，且在检测低丰度miRNA时欠灵敏。经典的Northern杂交技术仍不可替代，特别是在验证芯片结果及降低其假阳性方面起着至关重要的作用。

荧光定量PCR:可用于miRNA表达水平的定量检测，且具有特异性高、灵敏度好、重复性好、快速简单等优点，主要方法有茎环法［32］和加尾法［33］等。与杂交方法相比，PCR方法可以高度灵敏地检测出低丰度表达的靶分子，并适于高通量筛选。此法既可检测小RNA前体，又可检测成熟小RNA的表达。

RNA酶保护分析:是一种基于液相杂交的新方法，具有简单、快速、灵敏度高的特点，是Northern杂交的100倍。但由于价格昂贵，目前尚难于广泛应用。

磁珠流式检测:其原理是将结合探针的磁珠浸入到由两种不同荧光染料组成的混合物中，RT-PCR法扩增miRNA，产物与磁珠上的探针杂交，经染色后用流式细胞仪对彩色磁珠计数，颜色代表特定的miRNA，信号强度则表示其丰度。此方法能更好地捕获待测靶miRNA分子，最大程度地避免固态芯片中的交叉反应，但需对磁珠进行预先编码和杂交后解码，且成本较高。

原位杂交:可直观了解miRNA的时空表达模式，常用地高辛、生物素、荧光标记等方式。锁核苷酸(locked nucleic acid，LNA)探针因其与靶分子结合后可以增加异源双链分子的热力学稳定性，提高反应特异性，被广泛用于原位杂交。

miRNA表达谱芯片:芯片无疑是高通量检测miRNA表达情况的最佳选择，它以杂交为基础，目前已被广泛用于特异组织或细胞内miRNA表达谱的研究。此法对miRNA表达分析是间接的，在研究过程中仍存在特异性和灵敏度不高等缺点，因此结果存在一定的假阳性，需要辅助其他更为准确的表达研究方法加以验证。

miRNA深度测序:荧光定量PCR和表达谱芯片局限于检测已知 miRNA的表达，无法发现新的miRNA分子。miRNA深度测序技术能够直接对样本中特定大小的miRNA分子进行高通量测序，可以在无需任何miRNA序列信息的前提下研究miRNA的表达谱，并发现和鉴定新的 miRNA分子，为miRNA表达研究提供了更全面的方法，为进一步的深入研究奠定基础。

3.3 miRNA的功能研究

通常基因功能研究常常采用过表达或干涉(抑制、敲除)等方法，miRNA研究也不例外。前者通过提高该miRNA的表达水平，检测过表达所引起的细胞表型变化，初步阐释其可能的功能。体外合成双链RNA分子进入细胞内可以进一步被Dicer加工，得到成熟的miRNA，可用于瞬时作用的研究。稳定转染的细胞或动物实验研究需构建表达载体或选择病毒载体，蛋白质编码的载体可用于miRNA细胞水平的表达研究，病毒载体则可以直接用于动物实验，但是也有一定的局限性。需要注意的是，过表达研究中很难排除内源性表达的影响，因此，要得到理想的结果往往还需要功能抑制(loss-of-function)或敲除该miRNA来进一步验证。

基于miRNA自身的特点，可以在基因水平上抑制miRNA的表达，也可采用反义核酸分子抑制其表达。前者如条件性敲除miRNA的加工因子Dicer，可得到所有成熟miRNA的缺失体，但此方法无法获知单个miRNA的功能。在Dicer缺失情况下，单独过表达某种miRNA即可直接用于其功能研究。采用反义核酸分子，如2'-O甲基修饰物、LNA修饰物、miRNA拮抗剂antagomir等与靶miRNA互补结合，可达到抑制miRNA表达的目的。2'-O-甲基修饰物可用于miRNA的体外功能研究，但若进行体内实验则须采用antagomir。它具有剂量依赖性，并可达到miRNA长期抑制的效应，而且不会影响同一基因簇内其他miRNAs。

上述正反两方面的研究相结合可很好地用于miRNA的功能研究。

3.4 miRNA 靶基因的鉴定

miRNA的功能研究很大程度上与其所调控的靶基因有关，鉴定miRNA的靶基因是该领域研究的重要内容，同时也是难点。目前，靶基因的确定主要是以软件预测为主，根据miRNA与靶基因3'UTR结合的结构、热动力学等特点，借助生物信息学进行靶基因的预测。常见的靶标基因预测软件有TargetScan、PicTar、TargetScanS、miRanda、RNA22、RNA-hybrid、RNAFold、DIANA-MicroT 等［34］。

生物信息学方法预测的靶基因的数量往往要超过实际的数量，且存在假阳性，因此需要通过分子生物学实验进一步验证。通过过表达和抑制所要研究的miRNA，借助荧光报告基因系统，可用于鉴定受到该miRNA调节的基因以及该miRNA所影响和调控的生物学过程。导入化学合成的小分子miRNA mimics或拮抗剂antagomir，观察靶mRNA及编码蛋白表达以及细胞、动物水平的表型变化，进行信号通路研究，这是目前miRNA功能研究的常用方法。在确定了靶mRNA之后，找到位于3'UTR区的miRNA结合位点是研究者下一步关心的内容。通过生物信息学分析获得候选的miRNA结合区域，将野生型和结合位点突变的3'UTR序列克隆入荧光素酶报告载体，通过观察miRNA对发光强度的影响对结合位点加以验证。采用合适的报告基因系统验证miRNA对其靶基因的调控作用，简便易行，但仍存在一定局限性，即不能完全模拟细胞内真实的调控环境。因此，当探讨特异miRNA在某一生理或病理过程中的功能，寻找其靶基因时，应选择合适的细胞模型或其他有效的实验工具，以真实体现miRNA的调控作用，为其功能研究奠定基础。

4 结论与展望

随着对非编码RNA研究的不断深入，它们在细胞周期信号通路中的生物学意义日益凸现。miRNA不仅可通过加快细胞周期进程发挥促增殖效应，而且也能阻滞细胞周期产生抗增殖效应。一些miRNAs可能同时具有这两方面的效应，如miR-17-92簇中的部分miRNAs;另一些miRNAs则受细胞周期特异性转录因子(如c-Myc或E2F等)的调控。可见，miRNAs在细胞周期调控网络中作用具有复杂多样性。miRNAs的功能研究很大程度上与靶基因的确定有关，然而此领域的研究进展缓慢，很大程度上缘于目前尚无有效的大规模筛选并验证靶基因的方法。高通量的蛋白组学技术可能有助于此问题的解决，从而加快靶基因验证的步伐［35－36］。此外，同一种miRNA在不同的细胞内可能发挥不同的生物学效应，其靶基因也不尽相同，使其功能在细胞间存在较大差异。研究表明，miR-29b仅在细胞周期M期表达，其他阶段不表达或表达较低，而miR-29a的表达在细胞周期各个阶段均持续恒定地表达［37］，提示miRNAs的调控可能具有细胞周期特异性，但尚需进一步探讨。考虑到miRNAs在细胞周期调控及肿瘤发生发展中的重要意义，上述问题的解决将有助于进一步完善细胞周期调控网络，揭示肿瘤的发病机制。

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