三种加工方式海带中砷形态和含量的比较

赵梦醒， 刘 淇， 江志刚， 雷 敏， 曹 荣

（1.中国水产科学研究院 黄海水产研究所，山东 青岛 266071；2.青岛农业大学 食品科学与工程学院，山东 青岛 266109；3.山东出入境检验检疫局，山东 青岛 266001）

砷元素普遍存在于自然界各种生物体及环境组分中，砷复杂的新陈代谢方式和生物积累导致这一元素有超过25种不同的形态，并且有广泛的浓度范围[1]。砷的毒性与其化合物的性质，尤其与砷元素的化合价有关[2]。许多砷化合物对动植物都有毒性，其中无机砷被证明是人类的致癌物，而有机砷的毒性较小[3]；砷化合物毒性由大到小的顺序为:砷化氢＞三氧化二砷＞亚砷酸＞砷酸＞有机砷[4]。因此，在评价食品安全性时，食品中砷元素的形态是重要因素。

海藻是一种高纤维、高矿物质、低脂肪食品[5]。2002年，联合国粮农组织（FAO）调查显示，在亚洲，习惯上把海藻作为食品和药品的天然来源，中国、日本、韩国、越南和印度尼西亚是海藻的最大消费区[6]。我国藻类加工品产量增长迅速，2010年比2007年增长42.78%。近几年，我国海带（Laminaria japonica）每年海水养殖产量占藻类海水养殖产量的一半以上[7-8]。海带是提取海藻酸盐等物质的重要原料，也有相当一部分海带仅经过简单预处理（如晒干）后直接进入市场供消费者食用，海带在实际生产中主要以淡干海带或盐渍海带为主。

海藻中的砷含量较高，一般在20～60 mg/kg（以干重计）之间[9]，2006年海藻中无机砷超标问题对海藻加工企业造成严重损失[10]。砷的毒性与其形态密切相关，很多学者采用高效液相色谱（HPLC）、离子色谱（IC）、毛细管电泳（CE）等分离技术，结合电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）、原子荧光光谱（AES）等检测技术分析不同形态砷化合物[11-17]，但有关海带加工过程中砷形态和含量的变化情况研究较少。因此，本实验以不同加工方式的海带为研究对象，采用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法（HPLC-ICP-MS）测定海带中的砷形态，并进行定量分析，为海带加工品的开发提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验原料 新鲜海带 （Laminaria japonica），2011年5月采自山东荣成。将新鲜海带按以下3种方式加工处理。

Ⅰ组，直接干燥组:鲜海带冲洗后直接晒干，然后烘干粉碎至40目备用；

Ⅱ组，漂烫组:鲜海带100℃漂烫2 min，自来水冷却后晒干，最后烘干粉碎至40目备用；

Ⅲ组，漂烫-盐渍-水洗组:鲜海带100℃漂烫2 min，自来水冷却，沥水，盐渍（无碘盐质量分数）25%，盐渍时间72 h），冲洗3次，自来水浸泡12 h，再冲洗3次后晒干，最后烘干粉碎至40目备用。

1.1.2 仪器 BSA 224S-CW型分析天平，德国Sartorius公司产品；MARS EXPRESS微波消解仪，美国CEM公司产品；7500cx型电感耦合等离子体质谱仪，美国Agilent公司产品；1260型高效液相色谱仪，美国Agilent公司产品；AFS-2201双道氢化物发生原子荧光光度计，北京海光仪器厂产品；SA-10原子荧光形态分析仪，北京吉天仪器有限公司产品；Milli-Q超纯水系统，美国Millipore公司产品；KQ5200DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司产品；TGL-20B型离心机，上海安亭科学仪器厂产品；InoLab pH740型pH计，德国WTW公司产品；涡旋混合器，德国IKA公司产品。

Halmilton PRP-X100阴离子色谱柱 （10 μm，250 mm×4.1 mm），PEEK 管 （φ=0.18 mm）；0.45 μm水相微孔滤膜，天津市科亿隆实验设备有限公司提供。

1.1.3 试剂 标准品:亚砷酸根（AsⅢ）、砷酸根（AsⅤ）、一甲基砷（MMA）、二甲基砷（DMA）、砷胆碱（AsC）、砷甜菜碱（AsB），购于中国计量科学研究院；磷酸氢二铵（分析纯），上海试剂二厂产品；甲酸（优级纯），天津市光复精细化工研究所提供；硝酸（优级纯），德国MERCK公司产品。

1.2 方法

1.2.1 海带中总砷含量测定方法 准确称取烘干后的海带粉0.5 g（精确至0.001 g），放入微波消解罐中；加入5 mL HNO3，静置30 min，将消解罐放入微波消解仪中，设定消解程序和参数（如表1所示）并消解；消解后用超纯水定容至50 mL；用ICP-MS测定消解液中的总砷含量，同时测定试剂空白。

表1 微波消解操作程序Table 1 Operating program for microwave digestion system

1.2.2 海带中无机砷含量测定方法 采用高效液相色谱-氢化物发生原子荧光联用技术[18]。

1.2.3 砷形态测定方法

1）流动相的配制

20 mmol/L磷酸氢二铵:称取2.6412 g磷酸氢二铵，加水溶解并定容至1 L。用质量分数10%甲酸调 pH 至 6.0（±0.1），0.45 μm 水相微孔滤膜过滤，超声20 min脱气。

2）标准溶液的配制

砷标准储备液:亚砷酸根、砷酸根、一甲基砷、二甲基砷、砷胆碱（以下简称5种砷）及砷甜菜碱，用超纯水配制每种标准储备液的质量浓度为5 μg/mL，于4℃冰箱保存；

砷标准溶液:将5种砷的标准储备液及砷甜菜碱标准储备液逐级稀释，以20 mmol/L（NH4）2HPO4溶液（pH 6.0）为介质，配制成质量浓度分别为5、10、20、40、100 ng/mL 的混合标准溶液。 利用 ICPMS色谱软件计算色谱峰的积分面积，得到不同浓度梯度的砷形态标准曲线。

3）ICP-MS 工作条件

RF功率1 510 W；雾化器为同心雾化器，用PEEK管将色谱柱与雾化器的入口连接；雾化室温度2℃；蠕动泵转速12 r/min；采样深度7.4 mm；载气流量0.84 L/min；辅助气流量0.31 L/min。

4）色谱条件

色谱柱:Halmilton PRP-X100阴离子色谱柱（10 μm，250 mm× 4.1 mm）；流动相:20 mmol/L 磷酸氢二铵，pH 6.0，等度洗脱；进样体积 50 μL；体积流量1.0 mL/min。

5）样品前处理

称取0.1 g左右（精确至0.001 g）海带粉，加入10 mL 20 mmol/L （NH4）2HPO4溶液（pH 6.0），涡旋混匀，超声萃取40 min；8 000 r/min离心10 min，吸取上清液，用0.45 μm滤膜过滤，此滤液即为样品提取液。

1.2.4 样品提取液中总砷含量测定方法 移取0.5 mL样品提取液，加入1 mL硝酸，用超纯水定容至10 mL。采用ICP-MS测定提取液中的总砷含量。

1.2.5 标准曲线绘制方法 对质量浓度分别为5、10、20、40、100 ng/mL 的 5 种砷混合标准溶液和砷甜菜碱标准溶液的砷形态进行HPLC-ICP-MS分析，以砷质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.6 数据处理 采用SPSS 17.0统计软件对数据进行 T-检验比较分析，结果用平均值±标准差（±s）表示。

2 结果与分析

2.1 海带样品中的总砷和无机砷含量

表2是不同加工方式海带样品的总砷和无机砷含量。从表中可知，无机砷含量占总砷含量的百分比小于1%；与直接干燥海带相比，漂烫后海带的总砷和无机砷含量均减少，无显著差异（P＞0.05）；漂烫-盐渍-水洗组海带的总砷含量下降了45.75%，差异极显著（P＜0.01）。海带经盐渍水洗后砷含量明显减少，与孙建璋等[19]认为在热烫、盐渍过程中海带含砷量降低的结论相一致。

表2 不同加工方式海带样品中总砷和无机砷含量Table 2 Contents of total arsenic and inorganic arsenic in kelps

2.2 海带样品中不同砷的形态及含量

2.2.1 标准曲线的绘制 图1、2分别是40 ng/mL的5种砷混合标准溶液和砷甜菜碱标准溶液的色谱图，线性回归方程如表3所示，各种形态砷的线性回归方程相关系数R≥0.999 8，在5.0～100.0 ng/mL范围内具有良好的线性关系。

图1 40 ng/mL 5种砷混合标准溶液HPLC-ICP-MS色谱图Fig.1 HPLC-ICP-MS chromatogram of 40 ng/mL mixed standard solution

图2 40 ng/mL AsB标准溶液HPLC-ICP-MS色谱图Fig.2 HPLC-ICP-MS chromatogram of 40 ng/mL AsB standard solution

表3 不同形态砷的线性回归方程Table 3 Linear regression equations of different arsenics

2.2.2 样品分析 不同海带样品中的砷形态及含量如表4所示。结果表明，海带中的砷主要以有机砷形态存在，包括3种未知砷化合物；直接干燥海带中的已知砷形态为AsC、AsB、DMA和少量AsⅤ；与直接干燥海带比较，漂烫海带和漂烫-盐渍-水洗海带中的AsC含量明显下降，差异显著（P＜0.05），漂烫海带中的As1和As2含量显著下降（P＜0.01或P＜0.05），漂烫-盐渍-水洗海带中的砷化合物As1、As2 和 As3 含量下降明显（P＜0.01 或 P＜0.05）；海带经漂烫、盐渍水洗后AsⅤ含量降低；含量毒性相对较大的AsⅢ在3种海带样品中均未检出。海藻中的砷主要以有机形态存在，无机砷含量很低，约占总砷含量的5%以内[20-21]，李卫华等[22]、韦超[23]在海带样品提取液中均未检出无机砷。高继庆[24]采用氢化物发生原子荧光技术对干海带、盐渍海带和鲜海带（以湿重计）中的无机砷进行了测定，在扣除水分的影响后，盐渍海带中的无机砷含量下降，与本研究结果趋势相一致。

表4 不同海带样品中砷形态及含量Table 4 Species and contents of arsenic in kelps

图3是直接干燥海带样品的HPLC-ICP-MS色谱图，通过保留时间可以判定，As1、As2、As3三种化合物均为有机砷。因此，海带中的砷主要以有机砷形态存在。从表4可知，漂烫海带中As1、As2与直接干燥海带相比有明显减少，而漂烫-盐渍-水洗海带中As1、As2、As3含量均有所下降，与海带中总砷含量变化趋势相一致，可见砷含量的减少主要是有机砷含量的减少。研究表明，海藻中砷化合物的主要形态是砷糖。孟昭宇[9]研究了水产品中不同价态的砷，发现海藻中砷糖是最主要的砷化物形态，与Toni Llorente-Mirandes等[17]检测结果一致；李卫华等[22]研究发现海带中的砷形态是砷糖PO4、砷糖OH、砷糖 SO3和 DMA；Rehema Tukai等[25]采用微波辅助提取、HPLC-ICP-MS技术检测了褐藻中的砷形态包括砷糖PO4、砷糖OH、砷糖SO3及少量DMA、AsⅢ和MMA；韦超[23]对海带样品中砷形态进行了研究，在样品提取液中检测到砷糖PO4、砷糖OH、砷糖SO3和DMA，其中3种砷糖与本实验中As1、As2、As3的出峰位置相似，据此推测这3种有机砷是砷糖。由于砷糖标准品没有商品化，因此无法对砷化合物As1、As2、As3进行定性和定量。目前，已经有学者从天然物质中分离出砷糖作为标准品[22，25]，或者采用高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术测定未知砷化物的精确分子量[16]，以此来对砷糖进行定性。由于有机砷的C-As键结合牢固，在人体内不能分解和蓄积，毒性很低，基本以原形排除体外[26]，砷糖是海带中的主要砷形态，因此未见有食用海带而发生砷中毒的报道。

图3 直接干燥海带样品的HPLC-ICP-MS色谱图Fig.3 HPLC-ICP-MS chromatograms of direct drying kelp

图4是3种海带提取液中不同砷形态含量测定结果的比较。结果显示，海带提取液中3种砷糖化合物含量总和均占总砷含量的95%以上，因此对海带的毒性影响较小；直接干燥海带、漂烫海带和漂烫-盐渍-水洗海带样品的提取效率（提取液中总砷含量与样品中总砷含量的比值）分别是88.59%、58.00%和29.95%，说明不同样品用相同方法提取时，提取效率存在较大差异，与余晶晶等[27]、Slejkovec等[28]的研究结果一致。

图4 海带中不同形态砷含量结果Fig.4 Results of contents of arsenic in extract

3 结语

1）采用ICP-MS方法对不同加工方式的海带进行总砷测定，直接干燥海带、漂烫海带和漂烫-盐渍-水洗海带的总砷含量分别为47.23、42.91 mg/kg和25.62 mg/kg；与直接干燥海带相比，漂烫后海带总砷含量下降9.15%；漂烫-盐渍-水洗海带总砷含量下降45.75%。

2）通过对海带加工过程中砷形态和含量的比较，HPLC-ICP-MS色谱图显示，直接干燥海带和漂烫海带中含有砷胆碱、砷甜菜碱、二甲基砷和少量五价无机砷；漂烫-盐渍-水洗海带中含有砷胆碱、二甲基砷、少量一甲基砷和五价无机砷；3种不同加工方式海带中均含有3种砷糖化合物，其质量约占总砷质量的95%以上，无机砷所占比例小于总砷质量的1%。

3）随着漂烫或盐渍水洗次数的增加，海带中总砷含量下降，且3种砷糖化合物对总砷含量的降低起主要作用。因此，在直接食用或加工海带时可进行漂洗或水洗，以减少海带砷的摄入量。

[1]Valery M Dembitsky，Tomas Rezanka.Natural occurrence of arseno compounds in plants，lichens，fungi，algal species，and microorganisms[J].Plant Science，2003，165（6）:1177-1192.

[2]John S Edmonds，Kevin A Francesconi.Arsenic in seafoods:Human health aspects and regulations[J].Marine Pollution Bulletin，1993，26（12）:665-674.

[3]Tomas Rezanka，Karel Sigler.Biologically active compounds of semi-metals[J].Phytochemistry，2008，69（3）:585-606.

[4]Syoko Fukuda，Misaki Terasawa，Kazuo Shiomi.Phosphatidylarsenocholine，one of the major arsenolipids in marine organisms:Synthesis and metabolism in mice[J].Food and Chemical Toxicology，2011，49（7）:1598-1603.

[5]Ródenas de la Rocha S，Sánchez-Muniz F J，Gómez-Juaristi M，et al.Trace elements determination in edible seaweeds by an optimized and validated ICP-MS method[J].Journal of Food Composition and Analysis，2009，22（4）:330-336.

[6]Victoria Besada，José Manuel Andrade，Fernando Schultze，et al.Heavy metals in edible seaweeds commercialised for human consumption[J].Journal of Marine Systems，2009，75（1-2）:305-313.

[7]农业部.2008年渔业统计年鉴[C].北京:农业部渔业局，2009.

[8]农业部.2010年全国渔业统计数据[C].北京:农业部渔业局，2011.

[9]孟昭宇.水产品中不同价态砷的安全性研究[D].青岛:中国海洋大学，2005:2-3.

[10]吴成业，王奇欣，刘智禹，等.海藻中无机砷超标问题研究[J].水产学报，2008，32（4）:644-650.WU Cheng-ye，WANG Qi-xin，LIU Zhi-yu，et al.The survey on overmeasure of inorganic arsenic in seaweed[J].Journal of Fisheries of China，2008，32（4）:644-650.（in Chinese）

[11]赵云强，郑进平，杨明伟，等.毛细管电泳-电感耦合等离子体质谱法测定藻类中6种不同形态的砷化合物[J].色谱，2011，29（2）:111-114.ZHAO Yun-qiang，ZHENG Jin-ping，YANG Ming-wei，et al.Speciation analysis of arsenic in seaweeds by capillary electrophoresis-inductively coupled plasma mass spectrometry[J].Chinese Journal of Chromatography，2011，29（2）:111-114.（in Chinese）

[12]郭莹莹.海藻中砷化合物检测技术研究及食用安全性评价[D].青岛:中国海洋大学，2008:31-34.

[13]杨丽君，宋晓华，陈丽娟，等.高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法同时测定果蔬中6种砷形态[J].分析实验室，2011，30（7）:62-66.YANG Li-jun，SONG Xiao-hua，CHEN Li-juan，et al.Simultaneous analysis of 6 arsenic speciations in fruits and vegetables by high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma mass spectrometry[J].Chinese Journal of Analysis Laboratory，2011，30（7）:62-66.（in Chinese）

[14]吕超，刘丽萍，董慧茹，等.高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用技术测定水产类膳食中5种砷形态的方法研究[J].分析测试学报，2010，29（5）:465-468.LV Chao，LIU Li-ping，DONG Hui-ru，et al.Analysis of five arsenic speciations by high performance liquid chromatography and inductively coupled plasma mass spectrometry[J].Journal of Instrumental Analysis，2010，29（5）:465-468.（in Chinese）

[15]García Salgado S，Quijano Nieto M A，Bonilla Simón M M.Optimisation of sample treatment for arsenic speciation in alga samples by focussed sonication and ultrafiltration[J].Talanta，2006，68（5）:1522-1527.

[16]高杨，曹煊，余晶晶，等.高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用技术测定干海产品中砷化学形态[J].分析化学，2009，37（12）:1738-1742.GAO Yang，CAO Xuan，YU Jing-jing，et al.Determination of arsenic and its species in dry seafood by high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma mass spectrometry[J].Chinese Journal of Analytical Chemistry，2009，37（12）:1738-1742.（in Chinese）

[17]Toni Llorente-Mirandes，Maria José Ruiz-Chancho，Mercedes Barbero，et al.Measurement of arsenic compounds in littoral zone algae from the Western Mediterranean Sea:Occurrence of arsenobetaine[J].Chemosphere，2010，81（7）:867-875.

[18]尚德荣，宁劲松，赵艳芳，翟毓秀，等.高效液相色谱 氢化物发生原子荧光（HPLC-HG-AFS）联用技术检测海藻食品中无机砷[J].水产学报，2010，34（1）:132-138.SHANG De-rong，NING Jin-song，ZHAO Yan-fang，et al.Detection of inorganic arsenic in seaweed food using HPLC-HG-AFS[J].Journal of Fisheries of China，2010，34（1）:132-138.（in Chinese）

[19]孙建璋，孙庆海.海带（Laminaria japonica Aresch）含砷问题的探讨[J].现代渔业信息，2004，19（12）:25-27.SUN Jian-zhang，SUN Qing-hai.A diseussion on problem of arsenic content in kelp，Laminaria japonicus aresch[J].Mordern Fisheries information，2004，19（12）:25-27.（in Chinese）

[20]范晓，孙飚.海藻中砷的化学形态及代谢机制[J].海洋科学，1997（3）:30-34.FAN Xiao，SUN Biao.Studies on chemical forms and metabolic mechanism of arsenic in seaweeds[J].Marine Sciences，1997（3）:30-34.（in Chinese）

[21]杨钊，范莹，迟少云，等.7种藻类中总砷和无机砷含量的测定[J].中国海洋药物杂志，2007，26（2）:43-46.YANG Zhao，FAN Ying，CHI Sao-yun，et al.Determination of total arsenic and inorganic arsenic in seven kinds of algae[J].Chinese Journal of Marine Drugs，2007，26（2）:43-46.（in Chinese）

[22]李卫华，刘玉海.高效色谱-电感耦合等离子体质谱分析海藻类海产品中砷的形态[J].分析试验室，2012，31（8）:74-78.LI Wei-hua，LIU Yu-hai.Analysis of arsenic speciation in algae by high performance chromatography coupled inductively coupled plasma-mass spectrometry[J].Chinese Journal of Analysis Laboratory，2012，31（8）:74-78.

[23]韦超.砷元素形态分析的方法研究及其在食品安全领域的应用[D].北京:清华大学，2004:39-40.

[24]高继庆.海藻中形态砷的分析及受加工工艺影响的研究[D].青岛:中国海洋大学，2008:31-32.

[25]Rehema Tukai，William A Maher，Ian J McNaught，et al.Ellwood.Measurement of arsenic species in marine macroalgae by microwave-assisted extraction and high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma mass spectrometry[J].Analytica Chimica Acta，2002，457:173-185.

[26]李洁粒.海带中砷铅含量超标的危害及原因是什么[J].质量报告专刊，2006（1）:35.LI Jie-li.Whant are the hazards and reasons for the excessive content of arsenic and lead in kelp[J].Supervision and Choice，2006（1）:35.（in Chinese）

[27]余晶晶，曹煊，崔维刚，等.高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱测定浒苔中砷及砷化学形态[J].食品科学，2009，30（16）:223-227.YU Jing-jing，CAO Xuan，CUI Wei-gang，et al.High performance liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry for the determination of arsenic content and speciation in enteromorpha[J].Food Science，2009，30（16）:223-227.（in Chinese）

[28]Zdenka Slejkovec，Emese Kapolna，Ildi Ipolyi，et al.Arsenosugars and other arsenic compounds in littoral zone algae from the Adriatic Sea[J].Chemosphere，2006，63:1098-1105.