保护剂对胆固醇氧化酶稳定性机理的研究

陈 亦， 辛 瑜， 杨海麟， 张 玲， 张玉然， 仝艳军， 王 武

（江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡214122）

胆 固 醇 氧 化 酶 （cholesterol oxidase；COD；EC 1.1.3.6）属于黄素蛋白，能专一催化胆固醇转化为胆甾-4-烯-3-酮，作为检测酶广泛应用于医疗检测领域，是重要的诊断酶制剂。

诊断用酶制剂应用中，酶稳定性是重要因素之一，因此增强诊断用酶稳定性，成为了极为迫切的现实问题。提高酶稳定性方法有蛋白质工程、固定化、添加保护剂等，其中添加保护剂具有方法简单、成本低等优点，已成为一种常用的方法。酶保护剂主要有辅基、蛋白质、多元醇、防腐剂等，其中醇类能提高酶稳定性。Liao Y等[1]使用甘油促使冻干的过氧化氢酶复性，随着甘油浓度上升，过氧化氢酶复性速率加快；Costa等[2]研究多种添加剂对过氧化氢酶的影响，其中甘油和聚乙烯乙二醇能增加其储存稳定性。

作者所在实验室重组菌株E coli BL21（DE3）/pET28a表达的COD稳定性较差，通过研究液态纯酶稳定机理，选择甘油和核黄素两种保护剂，结合光谱法研究保护机理，提供增强酶稳定性的有效方法，对该酶应用具有重要价值，也为其他酶类稳定性提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

1.1.1 菌种来源 重组菌株 E.coli BL21（DE3）/pET28a-COD:作者所在实验室保藏。

1.1.2 主要仪器 电热恒温水浴锅:上海医疗器械五厂制造；蛋白电泳仪:美国BIO-RAD公司制造；F-7000型荧光分光光度仪:日立公司制造；MOS-450 AF-CD圆二色性光谱仪:法国Bio-Logic公司制造。

1.2 实验方法

1.2.1 COD纯酶制备 菌种培养发酵培养见文献[3]，酶液亲和纯化见文献[4-5]，制备COD纯酶液。

1.2.2 COD酶活测定方法 胆固醇氧化酶测定方法:参见文献[6]。

1.2.3 甘油对COD稳定性影响 6 U/mL（0.15 mg/mL）、pH 7.5的纯酶液分别添加体积分数5%、10%、15%甘油，37℃水浴，定时取样测定其残余酶活，初始酶活为100%，计算酶活保留率（%）。取样测定溶液浊度（OD340nm），同时取样SDS-PAGE和圆二色性光谱分析（扫描范围190～250 nm）。

1.2.4 核黄素对COD稳定性影响 6 U/mL（0.15 mg/mL）、pH 7.5 的纯酶液分别添加 10、20、40 μmol/L核黄素，37℃水浴定时取样，测定残余酶活及浊度，并取样荧光分析。COD激发波长280 nm，发射波长280～400 nm；辅基FAD激发波长460 nm，发射波长460～620 nm。

2 结果与讨论

2.1 胆固醇氧化酶（COD）稳定机理研究

COD最适反应pH为7.5[7]，故实验选择37℃、酶浓度6 U/mL、pH 7.5研究酶稳定性，结果见图1。随时间延长酶活降低，45 h降至2.65%；初始酶液澄清透明，但随时间延长，酶分子运动速率加快，分子间碰撞速率增大，酶分子间聚集，溶液浑浊[8]。

图1 存储不同时间对COD酶活及浊度影响Fig.1 Effects of different time on cholesterol oxidase activity and turbidity

COD为单亚基蛋白质，相对分子质量59 000，SDS-PAGE电泳见图2。前4小时未产生多聚体，且目的条带粗细大致相同，说明酶自身未发生降解；而后逐渐出现多聚体条带，可能由于COD高级结构改变，导致分子间发生聚集作用。

图2 不同存储时间的COD SDS-PAGE图Fig.2 Analysis by SDS-PAGE after different time

蛋白质Trp、Tyr、Phe具有荧光性，FAD为 COD辅基，含异咯嗪环，也具荧光性[9]。图3a中COD最大荧光强度随时间延长先增加后减小，前8小时最大荧光强度逐渐增强，主要由于COD内部Trp、Tyr等疏水性基团逐渐暴露，导致荧光强度上升；后期最大荧光强度逐渐降低，可能由于聚集导致一些原本处于单分子表面的Trp、Tyr包裹于聚集体内部，荧光强度降低。

图3b显示辅基FAD荧光图谱，其最大荧光强度和最大发射峰变化均不明显。24 h内FAD荧光强度变化不大，通常COD与FAD结合摩尔比为1∶1，图3中与COD同等摩尔浓度的核黄素（B2）溶液荧光强度明显高于FAD，而且大肠杆菌不能提供充足FAD，且其自身不能进入细胞，只能通过将核黄素运输至胞内，并经浓缩和磷酸化作用转化为辅酶FAD[10]，因此推断COD大量表达过程中，由于辅酶FAD合成速度有限，未能完全结合FAD辅基。

图3 不同存储时间COD和FAD的荧光光谱图Fig.3 Fluorescence spectra of cholesterol oxidase（a） and FAD（b）under different time

在图4中，COD在24 h二级结构特征峰基本消失，说明其天然构象破坏，酶变性失活。

通过酶活力、浊度、SDS-PAGE、荧光光谱及圆二色性光谱分析，37℃存储过程中，COD内部疏水基团逐渐暴露，二级结构破坏，分子间聚集导致溶液浊度上升，酶分子变性，导致酶活力下降，同时荧光光谱显示COD在表达过程中未充分结合FAD。因此，导致溶液COD不稳定因素主要有酶蛋白聚集导致构象变化以及缺乏辅基FAD。

图4 存储不同时间COD圆二色性光谱Fig.4 CD spectra of cholesterol oxidase under different time

2.2 甘油对COD稳定性影响

图5表示不同甘油浓度对COD酶活及浊度影响，浓度愈大保护作用愈强，45 h时15%甘油组酶活保留率60.25%，而对照组酶活保留率仅为2.2%。图5b甘油组酶液浊度低于对照组，30 h对照组OD340nm为0.461，甘油组OD340nm最高值仅为0.077。

图5 不同甘油体积分数对COD酶活和浊度影响Fig.5 Effects on cholesterol oxidase activity （a） and turbidity（b）under different glycerol concentration

图6为不同体积分数甘油对COD的SDSPAGE图，a为对照组，8 h开始出现聚集体；5%甘油组30 h出现微量聚集体条带，而10%和15%甘油组45 h未出现聚集。

图6 不同甘油体积分数下COD的SDS-PAGE图Fig.6 Analysis by SDS-PAGE under different glycerol concentration

图7显示COD在添加不同体积分数甘油的CD光谱，对照组随时间的延长，二级结构逐渐丧失，24 h二级结构特征峰基本消失，酶分子基本变性；甘油对COD的保护作用明显，24 h COD二级结构保持较好，维持酶分子高级构象，使酶分子保持稳定。

图7 不同甘油浓度下COD的圆二色性光谱Fig.7 CD spectra of cholesterol oxidase under different glycerol concentration

甘油能提高溶液粘度和增加分子表面水化层，粘度上升减少肽链间的碰撞，抑制酶分子间聚集[11]，CD光谱显示甘油维持酶分子二级构象免遭破坏，维持酶分子天然构象，提高酶稳定性，表现酶活力相对稳定。

2.3 核黄素对COD稳定性影响

除诺卡氏菌Nocardia产的COD外[12]，其他微生物源的COD均以FAD为辅基，本实验中COD与FAD属于非共价结合，而且大量表达COD时未完全结合FAD，因此添加FAD类似物的核黄素（B2）研究对COD稳定性影响。

不同浓度B2对COD酶活及浊度的影响结果见图8。加入B2的酶活保留率与对照组没有明显差别，29 h对照组OD340nm0.348，B2组OD340nm最大为0.431，溶液浑浊产生聚集现象，B2对COD未起保护作用，可能由于B2未与COD结合或者B2虽于COD结合但并未抑制其聚集。

图8 不同B2浓度对COD酶活和浊度影响Fig.8 Effects on cholesterol oxidase activity （a） and turbidity （b） under different riboflavin concentration

图9是不同浓度B2存在下，COD内源荧光及B2荧光图谱，B2具有异咯嗪环，因此也具荧光性。图9a中随B2浓度增加，荧光强度增幅愈小，可能由于B2和COD结合，使一部分疏水基团内埋于内部疏水环境中，同时COD最大发射峰未明显移动，见图9b。图9c表示B2荧光光谱，随着时间延长其荧光强度逐渐降低，可能原因有两个，一是B2异咯嗪环与COD结合导致B2荧光猝灭，另一可能就是B2降解致使荧光强度降低。图3b中B2在24 h后荧光强度未发生明显变化，说明24 h内B2未发生降解，表示该现象是由于B2与COD结合导致荧光强度降低。

图9 不同B2浓度下COD和相应B2荧光图谱Fig.9 Fluorescence spectra of cholesterol oxidase under different riboflavin concentration

荧光光谱表明B2与COD结合，抑制一部分疏水基团暴露，但由于该抑制作用较弱，未能防止COD间聚集，溶液浊度上升，COD构象变化，对COD稳定作用不佳。由于甘油能防止酶分子间聚集，通过向酶液中添加10%甘油，再以COD与B2摩尔比 1∶1、1∶5、1∶10 添加不同浓度的核黄素，分析其对COD稳定性影响，结果见图10。随摩尔比升高，酶活保留率却逐渐降低，65 h对照组酶活保留率39.3%，摩尔比1∶1组酶活保留率31.4%，而摩尔比1∶10组的酶活保留率却只有9.8%，核黄素由异咯嗪基和核糖醇基构成的一种B族维生素[13]，核黄素的异咯嗪基虽与FAD结合域结合，但由于COD的FAD结合域口袋较浅，因此核黄素对COD稳定性作用不显著，而且摩尔比越大酶活保留率越低，可能由于过多的核黄素，其疏水基团与COD分子疏水基团结合，对COD构象具有不利影响，因此产生不利的稳定作用。

图10 不同摩尔比B2及甘油对COD活性影响Fig.10 Synthetic effects of different molar ratio of riboflavin and glycerol on cholesterol oxidase activity

3 结语

研究分析了COD不稳定机理，由于COD内部疏水基团暴露导致聚集以及缺乏辅基FAD，导致二级构象破坏，酶变性失活，造成酶分子不稳定。根据失活机理，选用甘油、核黄素两种保护剂，研究其对COD稳定性影响，甘油提高溶液粘度和分子表面水化层，防止分子间聚集，二级构象保持良好，酶活力相对稳定，酶稳定性提高；核黄素作为COD的辅基类似物，虽能与COD结合，抑制部分疏水基团暴露，但由于COD的FAD结合域口袋较浅，且过多核黄素的疏水基团与COD分子疏水基团结合，对COD稳定性产生不利的影响；实验结论不仅提供了可稳定COD酶液的方法，而且研究了其保护机理。

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