乐斯本对克氏原螯虾肝胰脏抗氧化系统的影响

丁正峰，薛晖，王晓丰，唐建清

(1.江苏省淡水水产研究所，江苏 南京210017;2.南京师范大学 生命科学学院，江苏 南京210097)

克氏原螯虾Procambarus clarkii 也称小龙虾，是近年来最具特色、最具潜力的养殖品种之一［1-3］。随着养殖集约化程度的不断提升，产业的快速发展中也凸显诸多问题，养殖水体的污染即为其中之一。稻虾轮作是目前大量采用的克氏原螯虾养殖模式，即在水稻收割后至翌年播种这段闲置时间，在稻田中放养克氏原螯虾。由于在农作物病虫害防治过程中，喷施的农药量平均只有25% ～50%沉积在作物上［4］，大部分进入农田土壤及水体，且部分农药在水中降解速度较慢［5］，极易对稻田水中的克氏原螯虾产生毒性，笔者所在课题组已先后多次接到疑因农药污染而导致克氏原螯虾死亡的报告。

乐斯本(Lorsban，LSB)又名毒死蜱(Chlorpyrifos)，世界卫生组织(WHO)将其列为二级中度危害杀虫剂，LSB是目前全球应用最广泛的农药之一［6-7］。在中国，2007年甲胺磷等高毒农药被禁用后，乐斯本作为替代产品在水稻等作物上的用量大幅增加，销售额居所有杀虫剂首位［8］。因此，了解LSB 对水环境的污染程度以及对克氏原螯虾的养殖风险非常必要。

LSB 对水产养殖品种及水环境的危害性是近年来的研究热点之一，但主要集中在对大型溞、轮虫、鱼类及南美白对虾等［7，9-14］的研究上，对克氏原螯虾毒性方面的研究鲜见报道。LSB 同其他有机磷类(OP)农药一样，会对生物体造成氧化胁迫，破坏氧自由基的代谢平衡，造成机体损伤［15］，而肝脏是机体最重要的解毒器官，对LSB 的亲和力较大，药物会通过不断被摄取而迅速积累［16］。本试验中，作者选择克氏原螯虾肝胰脏组织，通过检测肝胰脏内重要的抗氧化酶组分——超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性及谷胱甘肽(GSH)含量的变化［17］，研究了急性暴露对克氏原螯虾肝胰脏抗氧化系统的影响，旨在为合理地使用LSB 农药、开展克氏原螯虾的生态养殖和水产品质量安全控制提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 材料

克氏原螯虾取自江苏省淡水水产研究所盱眙试验基地，体质量为(20.0 ±1.7)g，头胸甲长为(42.5 ±3.7)mm，选取体质健壮、反应灵敏的个体用于试验，驯养7 d，试验前1 d 停止投喂。

LSB(100%分析纯，购自美国陶氏益农公司)是一种脂溶性有机磷酸脂类化合物，水溶性很低(＜2 mg/L)，但在溶媒二甲基亚砜(DMSO)中能够迅速且完全溶解［10］，因此，笔者采用DMSO 助溶的方式配制体积分数为0.01%的药液。

1.2 方法

1.2.1 试验条件 试验在聚乙烯塑料箱(58 cm×35 cm×34 cm)中进行，养殖用水为曝气3 d 的净化水。试验期间，每天采用便携式多参数水质分析仪(YSI-ADV6600)监测水质，pH 为6.5 ～7.5，总硬度(以CaCO3计)为(10 ～250)mg/L，试验温度为(20 ±2)℃，溶解氧(DO)≥7 mg/L，自然光照。为防止摄食的影响，试验期间不投喂饵料，驯养和试验期间虾生长正常。

1.2.2 试验设计 参照静水生物测试法［18］，试验期间不更换试验液，根据环境中LSB 残留的浓度范围［14］，设定2、10、20、40、80 μg/L 5 个LSB质量浓度梯度。每个浓度设2 个平行组，另设空白对照组和助溶剂DMSO 对照组，每组投放克氏原螯虾20 只，试验过程中观察虾的行为和中毒症状。中毒后，经多次刺激无反应则判断为死亡，将其捞出并记录死亡数。

1.2.3 组织匀浆的制备及酶活性的测定 用4 ℃预冷的生理盐水漂洗样品，再用滤纸吸去表面水分，按质量与体积比为1∶ 10 加入上述生理盐水，冰浴条件下，用超声波进行匀浆。匀浆液用冷冻离心机(Eppendorf 5810R)以4 000 r/min 离心10 min，取上清液备用。

酶活性的测定方法及活性单位(U)定义参见文献［19］。

1.2.4 指标计算 采用半数致死浓度(LC50)来表征LSB 对克氏原螯虾的毒性。采用寇氏(Karber)法［11］计算 24、48、96 h的LC50以 及lg(LC50)的95%置信限，并按下式计算安全浓度:

1.3 数据处理

试验数据均以平均数±标准差表示。用SPSS 16.0 软件对试验数据进行重复测量方差分析(Repeated Measures)和双因素方差分析(Two - Way ANOVA)，用SigmaPlot 11.0 软件作图。

2 结果与分析

2.1 LSB 对克氏原螯虾的急性毒性

试验期间，空白对照组、DMSO 对照组均未发现虾中毒或死亡，其他试验组在中毒初期，虾急速爬动，有些表现为腹部朝上，翻身困难，附肢抖动，随着中毒时间的延长，动作变得迟缓，逐步丧失运动能力，翻转后附肢不停抽搐，最后躺卧箱底。

从图1可见:随着LSB 质量浓度的增加，其毒性作用不断增强，虾死亡率逐渐上升;随着暴露时间的延长，同一浓度组LSB 对克氏原螯虾的毒性作用亦随之增强。相同暴露时间内，LSB 浓度越高，虾死亡率越大;相同LSB 浓度条件下，染毒时间越长，虾死亡率越高。

图1 LSB 质量浓度和暴露时间对克氏原螯虾死亡率的影响Fig.1 The effects of LSB concentration and exposure period on the mortality of the crayfish

以Karber 方程对试验结果进行统计分析，得出24、48、96 h 的LC50分别为(28.24 ±2.81)、(19.52±2.03)、(13.13±1.71)μg/L，安全浓度为(2.79 ±0.31)μg/L，LC50随着暴露时间(t)的延长呈显著下降趋势，符合双曲线衰减模型(图2):

图2 LC50随试验时间变化的双曲线衰减模型拟合Fig.2 The LC50 decreased with period and fitted with the hyperbolic decay model

2.2 LSB 对克氏原螯虾肝胰脏抗氧化酶活性的影响

从图3可见:在染毒24 h和48 h 时，药物对克氏原螯虾肝胰脏SOD 活性的影响均不显著(P ＞0.05);在染毒96 h 时，LSB 质量浓度为20 μg/L的条件下，SOD 活性被诱导表达到最大值;之后随药物浓度的升高SOD 活性又下降。在时间和LSB 浓度的共同作用下，SOD 活性表现出显著性差异(P=0.045＜0.05)(表1)。

表1 时间和LSB 浓度对克氏原螯虾肝胰脏抗氧化酶活性的交互影响结果Tab.1 The two－way ANOVA on the interaction between exposure period and LSB concentration on parameters of the hepatopancreatic oxidative stress response

从图3可见:在低浓度(2 μg/L)染毒条件下，克氏原螯虾肝胰脏CAT 活性随时间的变化不大;当LSB 的质量浓度为10 μg/L 时，对CAT 活性具有激活作用，酶活性较对照组和低浓度组高，之后随着药物浓度的升高CAT 活性有下降趋势。染毒48 h 时的CAT 活性变化与染毒24 h 时的变化趋势相似，但其活性较24 h 低;染毒96 h 时，CAT 活性变化趋势较大，在LSB 质量浓度为20 μg/L 时，CAT 活性达到了最大值，之后随药物浓度的升高CAT 活性降低。CAT 活性随时间和药物浓度的变化呈极显著性差异(P＜0.001)(表1)。

从图3可见:药物浓度对肝胰脏GSH 含量的影响不大，在低浓度组染毒条件下其含量基本没变化，当LSB 质量浓度达到20 ～80 μg/L 时，其24 h和48 h 时的GSH 含量有所下降，96 h 的GSH 含量则维持在较高水平。GSH 含量的变化在时间上出现了极显著性差异(P＜0.001)(表1)。

图3 时间、LSB 质量浓度对克氏原螯虾肝胰脏SOD、CAT、GSH 的影响Fig.3 The effects of exposure period and LSB concentration on the activities of SOD，and CAT，and GSH levels in the hepatopancreas of the crayfish

3 讨论

3.1 控制LSB 对克氏原螯虾毒性影响的措施

进行急性毒性试验对阐明受试动物的毒性作用具有重要意义，是进行药物安全评价的重要手段。LSB 对新糠虾Neomysis integer、隆线溞Daphnia carinata、南美白对虾Penaeus vannmei、乌鳢Channa punctatus、罗非鱼Oreochromis niloticus等的96 h LC50分 别 为 0.13、0.24、0.89、81.98、1.57 μg/L［4，9-14］，表明其对水生动物均有极高毒性，即使携带极微量LSB 的稻田水流入养殖水体，也会对养殖品种产生严重危害。吴长兴等［8］对水稻1 个生产季节的LSB 使用情况及灌排水进行了跟踪调查，发现在LSB 使用高峰期，排水对稻田周边水域造成严重污染，出水中LSB 残留量高达26.07 μg/L，远高于本试验中克氏原螯虾(2.79 ±0.31)μg/L 的安全浓度。此外，2008年台湾市场上23%的水产品检测出LSB 残留，通过对11 家水产养殖场的所有环节进行排查，发现在所投喂的饲料中存在高LSB 残留［20］，每天投喂这些饲料使得农药在动物体内大量积累，并最终会通过食物链传递给人类，因此，研究并控制LSB在养殖水体中的扩散污染，对实现克氏原螯虾等水产品的健康养殖及水产品质量的安全保障具有重要意义。

水产养殖场应加强水源、器械及饲料等的管理，在养殖区域的田间应尽量避免连续施用LSB，并提前做好预防工作，如在每年7—8月稻田LSB使用的高峰期，可以采用微生物制剂对养殖水体中的有机磷农药进行净化处理［21］。此外，加强光照、提高水温与水体的pH，能够有效地促进LSB 的降解［5］。因此，养殖者应加强清塘管理，降低池塘水位后可采用底泥暴晒与生石灰泼洒相结合的方式，促进土壤及水体中LSB 的降解。

3.2 LSB 对克氏原螯虾肝胰脏抗氧化系统的影响

本试验中发现，克氏原螯虾在20 μg/L 的LSB溶液中暴露96 h 时，肝胰脏SOD 活性被诱导表达到最大值;之后随药物浓度的升高SOD 活性又下降，与Beaumont等［17］的研究结果类似，这种现象被称之为“毒物兴奋效应”［22］，当机体受到重度逆境胁迫时，SOD 活性通常降低［23-24］。此外，由于在抗氧化系统中，CAT 与SOD 协同发挥作用［17］，因此变化趋势较为相似，这与本试验结果一致，两种酶活性均显示先升后降的波动趋势。GSH 量的多少是衡量机体抗氧化能力大小的重要因素，缺乏或耗竭GSH 会促使很多化学物质或环境因素产生中毒作用或加重中毒作用［25］。本试验中，刚染毒的24 h，低浓度组(2 μg/L)克氏原螯虾肝胰脏GSH 含量明显降低，分析是由于此时机体消耗体内GSH 来抵御LSB 引起虾体内脂质过氧化物及过氧化氢堆积的原因;随着时间和药物浓度的提高，GSH 含量有所升高，表明长时间、高浓度的LSB对克氏原螯虾的抗氧化系统造成了损伤，抑制了GSH 的消耗，表现为含量上升。本试验表明，SOD和CAT 活性及GSH 含量变化可以反映克氏原螯虾受伤害的程度，并可用作克氏原螯虾安全性风险评价的参考依据。

此外，染毒时间越长，机体受损伤程度越严重，如果毒物浓度过小，则可能对水生动物组织不构成损伤［26］。由此可见，染毒时间和药物浓度均决定LSB 对克氏原螯虾的毒性效果。此次试验中也观察到低浓度组克氏原螯虾很少死亡，因此，在实际生产中，应控制水体中LSB 的质量浓度不高于(2.79 ±0.31)μg/L 这一安全浓度。

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