沼渣化学成分研究

刘丁才，朱洪光，许剑锋*

1上海海洋大学食品学院，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306;2同济大学现代农业科学与工程研究院，上海 200092

沼渣是投入沼气池内的原料经密封厌氧发酵后的固体残留物，主要被作为有机肥和饲料添加来研究和开发利用［1，2］。沼渣是大中型沼气工程厌氧发酵后的主要副产物之一，其内含有丰富的沼渣纤维、氨基酸、B族维生素、生长素、抗生素、有机酸、植物激素

及各种水解酶等生物活性物质［3］。研究还发现沼气发酵残留物对农田普遍发生的近30种病害具有防治作用，至少有20多种病害的防治效果达到或超过了现行使用的农药效果［4］。但是沼渣还未能得到充分利用［5］，这既造成了资源的浪费，又使能源环保型沼气工程的建设和推广受阻。因此，我们在大力发展大中型沼气工程的同时，还应加强沼渣的高值利用研究。为进一步明确沼渣的化学成分，使其得到更充分有效的开发和利用，本研究对鸡场沼渣进行了化学成分分析，初步分离到6个化合物，经鉴定，分别为 β-谷甾醇(1)、22β-羟基-12-齐墩果烯-3-酮(2)、21β-羟基-β-白檀酮(3)、29-羟基-12-土当归烯-3，22-二酮(4)、17β-雌二醇(5)、S(-)-雌马酚(6)。这些成分均首次从鸡场沼渣中分离得到。

其中，β-谷甾醇是一种植物固醇，多个在体和离体实验已证实其对结肠癌、前列腺癌、乳腺癌和子宫颈癌具有保护作用，且对人肝癌HepG2细胞具有较强的抑制作用［6］;最近研究表明17β-雌二醇除具有促进生殖系统发育和维持生殖功能外，对心血管等器官还有保护作用，主要有抗炎作用、抗氧化作用、抗凋亡作用等［7］。21β-羟基-β-白檀酮属于比较特殊的三萜，因为其有很好的抗肠贾第虫(Giardia intestinalis，亦名Giardia lamblia)活性，对肠贾第虫的半抑制浓度为 IC5027.4 μM［8］，而肠贾第虫是人体肠道感染的常见寄生虫之一，可引起腹痛、腹泻和吸收不良等症状。雌马酚属非甾体类雌激素，有R(+)-雌马酚和S(-)-雌马酚两种对应异构体，而S(-)-雌马酚是大豆素(daidzein)在部分人和动物肠道中特定微生物的代谢产物，至今发现的所有生物合成雌马酚都属S(-)-雌马酚且具有多种生物活性，如很强的抗氧化性、很好的心血管疾病保护作用、有助于妇女更年期症状的改善，同时流行病学研究和动物实验、体外实验也表明，S(-)-雌马酚有抗乳腺癌、前列腺癌等作用［9］;而对化合物 22β-羟基-12-齐墩果烯-3-酮和 29-羟基-12-土当归烯-3，22-二酮的作用的研究，目前还没有相关文献报道。

1 仪器和材料

Bruker AV-400型核磁共振仪，TMS为内标(Bruker公司);AB 3200 Q TRAP质谱仪(ABI公司);AUTOPOL V plus旋光仪(Rudolph公司);柱层析硅胶(200～300目;硅胶H)及薄层色谱板均购自青岛海洋化工厂;Sephadex LH-20(Pharmacia公司);石油醚(60～90℃)、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和甲醇均为上海国药分析纯。沼渣于2011年4月采自正常运转的上海市浦东新区六灶镇文彬养鸡场沼气池，经同济大学现代农业科学与工程研究院朱洪光教授鉴定为以鸡粪为原料进行产沼气厌氧发酵的固体残留物(Biogas residue)，沼渣标本存于上海海洋大学食品学院海洋与生物制药研究室。

2 提取分离

取与沼液分离的干沼渣1 Kg，用6 L无水甲醇搅拌浸提3次，每次1 d，浸提液用滤纸过滤后在50℃ 减压浓缩得浸膏27.2 g。将浸膏与粗硅胶拌样后进行硅胶柱层析(200～300目)，分别用纯氯仿、氯仿-甲醇(15∶1)洗脱得到A和B两部分，质量分别为10.1 g和5.3 g。A部分用硅胶柱层析(硅胶H)，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱(100∶0，30∶1，15∶1，8∶1，3∶1)，以 10% 浓硫酸乙醇溶液为显色剂进行薄层色谱分析合并后经反复硅胶柱层析(硅胶H，石油醚-乙酸乙酯)，得化合物 1(18 mg)，2(11 mg)，3(25 mg)和4(27 mg)。B部分直接用无水甲醇溶解，以无水甲醇为洗脱液进行 Sephadex LH-20洗脱纯化，得化合物5(11 mg)和6(36 mg)。

3 结构鉴定

化合物1 无色针状晶体(MSO-EtOAc);ESIMS m/z:437.6 ［M+Na］+，分子式 C29H50O;1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:5.37(1H，dd，J=5.2，2.3 Hz，H-6)，3.55(1H，tt，J=11.3，5.3 Hz，H-3)，2.31(1H，dd，J=13.0，5.0 Hz，H-4a)，2.27(1H，td，J=11.0，2.4 Hz，H-4b)，2.03(1H，dt，J=12.8，3.6 Hz，H-12a)，2.00(1H，td，J=12.1，2.4 Hz，H-8)，1.85-1.87(3H，m，H-1a，H-2a，H-16a)，1.68(1H，m，H-25)，1.03(3H，d，J=6.5 Hz，H-21)，0.89(3H，s，H-19)，0.85(3H，t，J=7.4 Hz，H-29)，0.85(3H，d，J=6.9 Hz，H-26)，0.84(3H，d，J=6.9 Hz，H-27)，0.71(3H，s，H-18);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:140.7(s，C-5)，121.7(d，C-6)，71.8(d，C-3)，56.7(d，C-14)，56.0(d，C-17)，50.1(d，C-9)，45.8(d，C-24)，42.3(s，C-13)，42.3(t，C-4)，39.7(t，C-12)，37.2(t，C-1)，36.5(s，C-10)，36.1(d，C-20)，33.9(t，C-22)，31.9(t，C-7)，31.8(d，C-8)，31.6(t，C-2)，29.1(d，C-25)，28.2(t，C-16)，26.0(t，C-23)，24.3(t，C-15)，23.0(t，C-28)，21.1(t，C-11)，19.8(q，C-26)，19.4(q，C-19)，19.0(q，C-27)，18.8(q，C-21)，12.0(q，C-29)，11.8(q，C-18)。以上质谱和核磁数据与文献［10］报道的β-谷甾醇数据基本一致，鉴定化合物1为β-谷甾醇。

化合物2 白色粉末;ESI-MS m/z:441.2［M+1］+，分子式 C30H48O2;1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:5.26(1H，t，J=3.6 Hz，H-12)，3.42(1H，t，J=5.1 Hz，H-22)，2.51(1H，ddd，J=15.4，11.0，7.4 Hz，H-2a)，2.36(1H，ddd，J=15.4，6.3，7.5 Hz，H-2b)，2.08(1H，d，J=14.5 Hz，H-18)，1.10(3H，s，H-27)，1.09(3H，s，H-23)，1.06(3H，s，H-25)，1.04(3H，s，H-24)，1.01(3H，s，H-30)，0.96(3H，s，H-26)，0.90(3H，s，H-29)，0.88(3H，s，H-28);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:217.8(s，C-3)，144.0(s，C-13)，122.6(d，C-12)，76.6(d，C-22)，55.3(d，C-5)，47.4(s，C-4)，46.9(d，C-9)，46.1(t，C-19)，45.0(d，C-18)，42.2(s，C-14)，41.5(t，C-21)，39.6(s，C-8)，39.3(t，C-1)，37.4(s，C-17)，36.7(s，C-10)，34.2(t，C-2)，32.7(q，C-29)，32.4(t，C-7)，30.5(s，C-20)，28.2(t，C-16)，28.2(q，C-30)，26.5(q，C-23)，25.8(t，C-15)，25.3(q，C-27)，23.6(t，C-11)，21.5(q，C-24)，20.0(q，C-28)，19.6(t，C-6)，16.9(q，C-26)，15.3(q，C-25)。以上质谱和核磁数据与文献［11］报道的22βhydroxy-12-oleanen-3-one数据基本一致，鉴定化合物 2 为 22β-羟基-12-齐墩果烯-3-酮。

化合物3 白色粉末;ESI-MS m/z:441.3［M+1］+，分子式 C30H48O2;1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:5.25(1H，t，J=3.4 Hz，H-12)，3.53(1H，dd，J=12，4.6 Hz，H-21)，2.57(1H，ddd，J=16，11，7.2 Hz，H-2a)，2.38(1H，ddd，J=16，6.7，3.6 Hz，H-2b)，2.00(1H，dd，J=14.8，3.5 Hz，H-18)，1.65(1H，dd，J=11.5，6.3 Hz，H-9)，1.33(1H，m，H-5)，1.14(3H，s，H-27)，1.11(3H，s，H-23)，1.07(3H，s，H-25)，1.06(3H，s，H-24)，1.01(3H，s，H-26)，0.97(3H，s，H-29)，0.89(3H，s，H-28)，0.86(3H，s，H-30);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:217.8(s，C-3)，143.8(s，C-13)，124.0(d，C-12)，74.0(d，C-21)，55.3(d，C-5)，47.5(s，C-4)，47.1(t，C-19)，46.8(d，C-9)，46.7(d，C-18)，45.3(t，C-22)，41.9(s，C-14)，39.7(s，C-8)，39.1(t，C-1)，36.5(s，C-10)，36.3(s，C-20)，35.0(s，C-17)，34.2(t，C-2)，32.1(t，C-7)，29.1(q，C-29)，28.3(q，C-28)，28.2(t，C-16)，26.5(q，C-23)，26.0(t，C-15)，25.9(q，C-27)，23.7(t，C-11)，21.5(q，C-24)，19.6(t，C-6)，17.0(q，C-30)，16.7(q，C-26)，15.3(q，C-25)。以上质谱和核磁数据与文献［12］报道的 21β-hydroxy-β-amyrenone 数据基本一致，鉴定化合物 3 为 21β-羟基-β-白檀酮。

化合物4 无色片状晶体(MeOH);ESI-MS m/z:457.3［M+1］+，分子式 C30H48O3;1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:5.33(1H，t，J=3.3 Hz，H-12)，3.32(2H，d，J=10.7 Hz，H-29)，2.59(1H，d，J=14.0 Hz，H-21a)，2.53(1H，ddd，J=15.3，11.0，7.3 Hz，H-2a)，2.38(1H，ddd，J=15.4，6.5，3.4 Hz，H-2b)，2.24(1H，t，J=13.8 Hz，H-19a)，1.21(3H，s，H-27)，1.08(3H，s，H-23)，1.06(3H，s，H-25)，1.04(3H，s，H-24)，1.00(3H，s，H-28)，0.99(3H，s，H-26)，0.88(3H，s，H-30);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:217.6(s，C-3)，217.0(s，C-22)，141.5(s，C-13)，123.8(d，C-12)，72.5(t，C-29)，55.3(d，C-5)，48.0(s，C-4)，47.5(s，C-17)，47.0(d，C-18)，46.8(d，C-9)，45.6(t，C-21)，42.0(s，C-14)，40.6(t，C-19)，39.8(s，C-8)，39.5(t，C-1)，39.0(s，C-20)，36.6(s，C-10)，34.1(t，C-2)，32.2(t，C-7)，26.8(t，C-16)，26.5(q，C-23)，25.3(q，C-27)，25.2(t，C-15)，23.6(t，C-11)，21.5(q，C-24)，21.0(q，C-30)，20.7(q，C-28)，19.6(t，C-6)，16.7(q，C-26)，15.2(q，C-25)。以上质谱和核磁数据与文献［11］报道的29-hydroxy-12-oleanene-3，22-dione数据基本一致，鉴定化合物4为 29-羟基-12-土当归烯-3，22-二酮。

化合物5 白色粉末;ESI-MS m/z:273.3［M+1］+，分子式 C18H24O2;1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:8.70(1H，s，3-OH)，7.09(1H，d，J=12.6 Hz，H-1)，7.00(1H，dd，J=10.4，6.5 Hz，H-2)，6.99(1H，dd，J=16.1，4.2 Hz，H-4)，3.92(1H，s，17-OH)，3.89(1H，t，J=17.0，8.4 Hz，H-17)，2.81(2H，t，J=2.5，6.2 Hz，H-6)，2.17(1H，m，H-11a)，2.09(1H，m，H-9)，1.79(1H，m，H-14)，1.79(2H，m，H-15)，1.78(1H，m，H-7b)，1.78(1H，m，H-16a)，1.73(1H，d，J=11.8 Hz，H-12b)，1.32(1H，m，H-16b)，1.29(1H，m，H-11b)，1.26(1H，m，H-7a)，1.12(1H，d，J=11.8 Hz，H-12a)，0.98(3H，s，H-18);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:154.8(s，C-3)，137.1(s，C-5)，130.4(s，C-10)，126.0(d，C-1)，114.9(d，C-4)，112.7(d，C-2)，80.0(d，C-17)，49.5(d，C-14)，43.5(d，C-9)，42.8(s，C-13)，38.7(d，C-8)，36.5(t，C-12)，29.8(t，C-16)，29.1(t，C-6)，26.9(t，C-7)，26.0(t，C-11)，22.7(t，C-15)，11.3(q，C-18)。以上质谱和核磁数据与文献［13］报道的17β-Estradiol(E2)数据基本一致，鉴定化合物5为17β-雌二醇。

化合物6 无色方晶(MeOH);ESI-MS m/z:243.1［M+H］+，分子式 C15H14O3;［α］20D=-27.4(c=0.14，MeOH);1H NMR(CD3OD，500 MHz)δ:7.08(2H，d，J=8.4 Hz，H-2'，H-6')，6.86(1H，d，J=8.2 Hz，H-5)，6.74(2H，d，J=8.5 Hz，H-3'，H-5')，6.31(1H，dd，J=8.2，2.4，H-6)，6.23(1H，d，J=2.4 Hz，H-8)，4.86(2H，s，4'-OH，7-OH)，4.18(1H，ddd，J=10.5，3.6，2.0 Hz，H-2a)，3.90(1H，t，J=10.5 Hz，C-2b)，3.01 ～ 3.06(1H，m，H-3)，2.80-2.89(2H，m，H-4);13C NMR(CD3OD，125 MHz)δ:157.6(s，C-7)，157.3(s，C-4')，156.2(s，C-9)，133.8(s，C-1')，131.1(d，C-5)，129.3(d，C-2'，C-6')，116.4(d，C-3'，C-5')，114.5(s，C-10)，109.1(t，C-6)，103.8(t，C-8)，72.2(t，C-2)，39.4(d，C-3)，33.04(t，C-4)。以上数据与文献［14］报道的 S(-)-equol基本一致，故鉴定化合物6为S(-)-雌马酚。

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