发酵轮叶党参皂苷对二乙基亚硝胺致小鼠肝细胞DNA氧化损伤的保护作用机制

俞 星，郑春姬，韩春姬,,*，姜国哲，崔成弼

(1.延边大学医学院预防医学教研部，吉林 延吉 133002；2.延边大学食品研究中心，吉林 延吉 133002)

二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine，DEN)是一种很强的化学致癌物，通常用于原发性肝癌动物模型的制作，可用于研究肝癌的发病机理及其防治。DEN诱发小鼠肝癌模型，其特点为诱癌成功率高，肝癌细胞所占比例大[1]，且其诱发的肿瘤多为肝细胞癌，与人肝细胞癌相似[2-3]。DEN诱发大鼠肝癌的过程要经过3个阶段，即肝硬变前期(1～8周)、肝硬变期(8～14周)、癌变期(14～20周)[4]。

轮叶党参(Codonopsis lanceolata)又名山海藻，属于桔梗科党参属植物，广泛分布于中国、韩国、朝鲜、日本等地。轮叶党参主要是作为山野菜食用，未见任何毒副作用。现代药理学研究表明，轮叶党参提取物具有抗氧化、抗衰老、抗突变、抗肿瘤、抗疲劳以及提高机体免疫力等作用[5-8]。本实验室前期的研究结果表明，轮叶党参提取物具有显著的预防化学性肝损伤的作用[9-10]。最近的研究结果表明，轮叶党参经活性酵母发酵后，其抗氧化活性明显增强[11]，但有关轮叶党参对化学致癌物DEN的早期肝脏损伤的保护作用尚未见报道。本实验旨在探讨发酵轮叶党参皂苷(fermentedCodonopsis lanceolatasaponin，FCLS)对DEN致小鼠肝细胞氧化损伤的保护作用及其机制，以期能为肝癌化学预防剂的开发提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

轮叶党参采集自吉林省延边州安图县。

DEN 日本半井化学药品株式会社；肝细胞中的细胞色素P4502E(CYP2E)抗体、二氨基联苯胺(DAB)试剂盒、SABC免疫组化试剂盒 武汉博士德生物工程有限公司；小鼠8羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)ELISA试剂盒、8-羟基鸟嘌呤-DNA糖苷酶(OGG1)ELISA试剂盒 上海研生生物科技有限公司，其他试剂均为市售分析纯。

1.2 仪器与设备

DG5033A酶联免疫检测仪 南京华东电子集团医疗装备有限责任公司；小动物IVC饲养系统 苏杭科技器材有限公司；BM-VI生物组织冷冻包埋机 孝感电子仪器厂；RM2125切片机 莱卡公司；BH2生物显微镜日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 FCLS的制备

轮叶党参采用活性酵母发酵，FCLS的制备方法同俞星等[12]的报道。新鲜轮叶党参，洗净浮土，切成2～3cm薄片，在60℃条件下烘干，粉碎成20目的粗粉，用活性酵母发酵6d[13]，用50%乙醇加热回流提取，滤液回收乙醇后减压浓缩，用乙酸乙酯萃取后再用正丁醇萃取，将后者上D10l大孔吸附树脂，依次用30%、50%、75%和95%乙醇洗脱，合并洗脱液，回收乙醇，减压干燥得到FCLS，采用香草醛-冰醋酸比色法测定总皂苷含量达到63%，其主要成分为Codonolaside、Lancemaside、刺囊酸等五环三萜类皂苷，其苷元为齐墩果酸。轮叶党参经活性酵母发酵之后，总皂苷含量达到7.34%(未发酵轮叶党参总皂苷含量为3.52%)，故本实验采用发酵方法处理后提取总皂苷。

1.3.2 动物分组及处理

雄性清洁级昆明种小鼠50只，体质量20～22g，由延边大学实验动物科提供，在本实验室IVC系统中饲养并进行实验。实验前先将动物适应性喂养3d，然后随机分为阴性对照组、单纯DEN组(隔日腹腔注射DEN 20mg/kg，以体质量计)、FCLS高、中、低3个剂量组(分别灌胃200、100、50mg/(kg·d)，以体质量计)，连续6周。

1.3.3 OGG1活性及8-OHdG含量测定

在最后1次给药后过24h，脱颈椎处死小鼠，每只小鼠取100mg左叶肝组织，加0.9mL生理盐水用冰浴匀浆，3000×g离心30min后取上清液，严格按试剂盒说明书进行操作。肝组织匀浆蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定。

1.3.4 肝组织中CYP2E1免疫组织化学染色

动物脱颈椎处死后，取肝脏。切取长宽不超过5mm，厚度不超过2mm的组织块，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片。CYP2E1表达的免疫组织化学染色，采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶免疫组织化学法(SP法)，DAB显色，一抗CYP2E-BAl774为兔来源的多克隆抗体，工作浓度为1:100，操作严格按试剂盒说明书进行。每次实验均设阴性对照，以PBS替代一抗，于光学显微镜下观察结果。

结果评定标准：CYP2E1阳性细胞表现为胞浆/胞膜呈棕黄色。每份切片取5个高倍视野(×400)，按以下方法进行半定量的计数方法：0级为阳性细胞数为0%～5%，Ⅰ级为阳性细胞数为6%～25%或染色强度较弱，棕褐色不明显。Ⅱ级为阳性细胞数为26%～50%，染色强度较深，棕褐色较明显。Ⅲ级为阳性细胞数＞50%，染色强度深，棕褐色明显。

1.4 统计学分析

用SPSS17.0软件进行数据分析，计量资料的显著性检验采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验。CYP2E1表达结果显著性检验采用秩和检验。

2 结果与分析

2.1 小鼠肝组织8-OHdG、OGG1含量

表1 各组肝匀浆中8-OHdG含量及OGG1活性比较(±s，n=10)Table 1 Comparison of 8-OHdG content and OGG1 activity in hepatic tissue from different groups (±s，n=10)

表1 各组肝匀浆中8-OHdG含量及OGG1活性比较(±s，n=10)Table 1 Comparison of 8-OHdG content and OGG1 activity in hepatic tissue from different groups (±s，n=10)

注：*.与阴性对照组比较，有显著性差异(P＜0.05)；#.与DEN组比较，有显著性差异(P＜0.05)；##.与DEN组比较，有极显著性差异(P＜0.01)。

组别 8-OHdG含量/(ng/L) OGG1含量/(pg/mL)阴性对照组 38.699±5.959 18.994±4.231 DEN组 54.979±4.688** 13.368±0.600*FCLS低剂量组 50.963±15.313 16.552±1.420##FCLS中剂量组 46.579±4.208## 18.026±3.705#FCLS高剂量组 45.488±2.360## 19.841±2.779##

由表1可知，DEN组肝组织匀浆中8-OHdG含量明显高于阴性对照组(P＜0.01)；FCLS高、中剂量组肝组织8-OHdG含量明显低于DEN组，其差异极显著(P＜0.01)，并随着FCLS剂量的增高，8-OHdG含量也随之减少。DEN组肝组织匀浆中OGG1含量明显低于阴性对照组(P＜0.05)，FCLS高、中、低3个剂量组肝组织匀浆中OGG1含量明显高于DEN组，其差异显著(P＜0.05或P＜0.01)，给药剂量与OGG1活性呈剂量-效应关系。

2.2 肝组织CYP2E1表达

图1 小鼠肝脏CYP2E1蛋白表达(SP，×400)Fig.1 Expression of CYP2E1 protein in hepatic tissue (SP，×400)

免疫组化显示棕黄色颗粒为CYP2E1蛋白表达阳性。由图1可知，在阴性对照组中CYP2E1表达阳性细胞在腺泡Ⅲ区分布很少，单纯给予DEN组CYP2E1表达阳性细胞从腺泡Ⅲ区延伸到腺泡Ⅱ区，而给予高剂量和中剂量FCLS的两个组CYP2E1表达阳性细胞主要分布在腺泡Ⅲ区。统计评定结果如表2所示，DEN组肝组织中CYP2E1蛋白表达阳性率明显高于阴性对照组(P＜0.01)；FCLS中剂量组和高剂量组肝组织CYP2E1蛋白表达阳性率明显低于DEN组，差异显著(P＜0.05或P＜0.01)。

表2 肝组织中CYP2E1蛋白表达的变化Table 2 Comparison of CYP2E1 protein expression in hepatic tissue from different groups

3 讨 论

有研究报道[14]，在DEN诱发小鼠肝癌实验中，给予DEN第4、6周时，小鼠肝癌干细胞标志CD133 mRNA的表达与对照组无差异，第8周CD133 mRNA的表达显著高于对照组，因此DEN诱发小鼠肝癌的过程中，第1～6周的病理变化主要是药物性肝炎的表现，包括部分肝细胞出现增生性改变，局部肝细胞的变性坏死和充血及出血。此阶段尚未形成肝癌细胞，应是肝癌预防的最佳阶段。本实验的前期研究结果表明轮叶党参皂苷能明显提高腹腔注射DEN 6周的小鼠肝组织超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物(GSH-Px)活性，并显著降低MDA含量，并减少DEN所致肝细胞DNA链断裂[15]，表明FCLS具有明显的提高抗氧化酶活性作用。8-OHdG是鸟嘌呤的氧化型，是由于DNA链上鸟嘌呤碱基的C-8位受到羟自由基及单线态氧的攻击，发生羟化而生成[16-17]，其结果导致G:C突变为T:A的DNA碱基颠换[18]。在临床和实验中8-OHdG常用作检测DNA氧化损伤、突变的重要生物标志物[19]。本研究结果表明，小鼠隔日注射DEN，连续6周，导致肝组织8-OHdG含量明显高于对照组，表明DEN导致小鼠肝细胞DNA氧化损伤。给予DEN的同时灌胃不同剂量的FCLS，肝组织8-OHdG含量明显低于单纯DEN组，且存在剂量依存性，表明FCLS能够拮抗DEN对肝细胞DNA的氧化损伤作用。由于DEN已被证明诱发动物肝硬变及肝癌，因此可推测FCLS对DEN诱发肝癌具有潜在的预防作用。

当DNA分子受自由基攻击而发生氧化损伤时，机体可通过自身修复机制修补受损的DNA分子，从而维持DNA的稳定性。机体内多种DNA氧化损伤修复方式中碱基切除修复是最重要的修复途径，因为自由基主要引起非烷基化DNA损伤，该损伤的修复需要碱基切除修复酶。OGG1是参与碱基切除修复过程的重要酶之一，并且在修复的过程中与个体对致癌物作用的敏感性密切相关。无论是OGG1基因突变或缺失，都能使细胞修复8-OHdG的能力降低或丧失，并且对个体患肿瘤的风险也随之增高[20]。头颈部鳞状细胞癌患者OGG1基因表达显著低于健康人，且OGG1基因表达降低可使患头颈部鳞状细胞癌的风险提高2倍以上[21]。本研究结果表明，单纯DEN组小鼠肝组织OGG1活性明显低于阴性对照组，而给予FCLS的小鼠肝组织OGG1活性明显高于单纯DEN组，表明DEN抑制小鼠肝细胞OGGl活性，减弱对氧化损伤的DNA的修复能力。用FCLS干预后通过上调OGGl的活性，提高切除DNA双链中的8-OHdG，恢复基因组中正常的G:C配对，使受损DNA得到修复。本研究结果中，FCLS高剂量组的OGG1活性略高于正常对照组，但其差异无统计学意义，因此认为FCLS在本实验条件下不发生OGG1过表达。

细胞色素P450(CYP)是研究较多的Ⅰ相代谢酶，作为肝脏主要代谢酶，该酶系有100多种同工酶，其中细胞色素P4502E1(CYP2E1)约占P450总量的7%，CYP2E1作为肝脏的重要代谢酶参与其发生发展，对乙醇、亚硝胺等肝毒性物质具有特异性的代谢作用，但其过表达可促进各种肝病的发生，并参与了多种消化道和呼吸道肿瘤的形成[22]。在外源性化合物和药物代谢的过程中，CYP2E1可把无活性的前致癌物代谢转变为亲电子化学物，亲电子化学物可以攻击细胞内的大分子，与DNA或蛋白质形成加成物，最终引起病变[23]。研究表明，CYP2E1参与肝毒性物质的活化，使前毒性物质或致癌物质与嗜电子衍生物结合，引起细胞毒性、死亡甚至癌变[24]。

本研究结果表明，与阴性对照组相比，DEN组细胞的CYP2E1蛋白表达增加，CYP2E1活性增强。该结果证实了DEN诱导CYP2E1蛋白在细胞内的表达，使CYP2E1活性增强，进而使细胞内的脂质过氧化增加，抗氧化物质减少。与DEN组相比，同时给予FCLS组肝细胞CYP2E1蛋白表达降低，说明FCLS可以抑制DEN诱导的CYP2E1活性的上调引起的反应性氧自由基产生的增多及其引起的代谢毒性。

Kim等[25]报道，用乳酸菌发酵轮叶党参前后的提取物对人类癌细胞生长抑制作用表现出明显的差异，即生轮叶党参提取物对人胃癌及乳腺癌细胞的生长抑制作用优于发酵轮叶党参提取物，而发酵轮叶党参提取物对人肝癌和肺癌细胞的生长抑制作用明显优于生轮叶党参，并认为其抑癌作用主要依赖于三萜皂苷。俞星等[12]用活性酵母发酵轮叶党参后提取总皂苷，进行体外实验结果表明，轮叶党参总皂苷能明显抑制人肝癌细胞HepG-2的增殖，并通过提高促进凋亡基因蛋白Caspase3,8,9活性，诱导HepG-2细胞凋亡。通过本次研究及已有的研究，认为经过活性酵母发酵的轮叶党参总皂苷提取物。本次实验结果表明轮叶党参经活性酵母发酵提取的轮叶党参皂苷对DEN诱发小鼠肝细胞DNA氧化损伤具有较好的预防作用，提示轮叶党参通过微生物发酵，其皂苷对肝癌具有一定的预防作用。关于轮叶党参经微生物发酵后某些药理活性的变化机制尚未见研究报道，有待于今后进一步研究。

综上所述，FCLS预防DEN致小鼠肝细胞DNA损伤的机制为通过降低CYP2E1活性，降低DEN在肝组织中的活化，通过提高抗氧化酶活性，清除DEN代谢过程中产生的过多的自由基和活性氧，从而阻止了肝细胞DNA的氧化损伤。同时通过提高OGG1基因表达，迅速清除DNA氧化损伤产生的加合物8-OHdG，修复受损DNA。

[1]GHOSH A, GHOSH D, SARKAR S, et al.Anticarcinogenic activity of nanoencapsulated quercetin in combating diethylnitrosamineinduced hepatocarcinoma in rats[J].Eur J Cancer Prev, 2012, 21(1):32-41.

[2]OKUBO H, MORIYAMA M, TANAKA N, et al.Detection of serum and intrahepatic hepatocyte growth factor during DEN-induced carcinogenesis in the rat[J].Hepatol Res, 2002, 24(4): 385-394.

[3]罗明, 贺平, 吴孟超, 等.苦参碱和氧化苦参碱对二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌的预防阻断作用[J].肿瘤防治杂志, 2000, 7(6): 561-563.

[4]丁仕义, 蔡金华.大鼠肝细胞癌模型的建立及MR成像研究[J].第三军医大学学报, 2002, 24(6): 643-645.

[5]韩春姬, 朴永泉.轮叶党参多糖对小鼠S180肉瘤的抑制作用[J].延边大学医学学报, 2000, 23(4): 249-250.

[6]KIM S H, CHOI H J, CHUNG M J, et al.Antimutagenic and antitumor effects of codonopsis lanceolata extracts[J].J Korean Soc Food Sci Nutr, 2009, 38(10): 1295-1301.

[7]韩春姬, 李莲姬.轮叶党参水提取液抗突变作用及其机理研究[J].预防医学文献信息, 1998, 4(3): 204-205.

[8]韩春姬, 李莲姬, 朴惠善, 等.轮叶党参对老年小鼠益智及抗氧化的作用[J].中药材, 1999, 22(3): 136-138.

[9]白雪松, 韩春姬, 鲍捷.复方轮叶党参预防乙醇性肝损伤作用机制研究[J].毒理学杂志, 2008, 22(1): 42-43.

[10]张亮, 韩春姬, 李莲姬, 等.复方轮叶党参对小鼠乙醇性肝损伤的预防作用[J].毒理学杂志, 2007, 21(4): 265-267.

[11]刘婷婷, 韩春姬, 俞星.发酵轮叶党参提取物清除DPPH自由基的作用[J].吉林大学学报: 医学版, 2011, 37(6): 1087-1089.

[12]俞星, 李林, 韩春姬, 等.轮叶党参总皂苷对HepG-2细胞凋亡的作用[J].吉林大学学报: 医学版, 2011, 37(6): 1090-1093.

[13]韩春姬, 朴惠善, 李美子.一种提高轮叶党参抗癌活性的方法: 中国, 201110032025[P].2011-06-15.http://www.zlptt.com:6060/list.asp?ID=4446261.

[14]唐超莉, 匡志鹏, 杨帆, 等.化学诱导小鼠肝癌模型中CD133的动态变化[J].肿瘤, 2012, 32(8): 585-591.

[15]郑春姬, 俞星, 韩春姬.轮叶党参皂苷对二乙基亚硝胺致肝细胞DNA 损伤的保护作用[J].食品科学, 2013, 34(11): 254-257.

[16]KITCHIN KT, AHMAD S.Oxidative stress as a possible mode of action for arsenic carcinogenesis[J].Toxicol Lett, 2003, 137(1): 3-13.

[17]邢彩虹, 李桂兰, 纪之莹, 等.单细胞凝胶电泳图像分析软件的比较[J].毒理学杂志, 2005, 19(2): 141-143.

[18]LIU Jing, WANG Yuan, CUI Jinfeng, et al.Ochratoxin a induces oxidative DNA damage and G1 phase arrest in human peripheral blood mononuclear cellsin vitro[J].Toxicol Lett, 2012, 211(2): 164-171.

[19]KU Y P, JIN M, KIM K H, et al.Immunolocalization of 8-OHdG and OGG1 in pancreatic islets of streptozotocin-induced diabetic rats[J].Acta Histochemica, 2009, 111(2): 138-144.

[20]BRAVARD A, VACHER M, GOUGET B, et al.Redox regulation of human OGG1 activity in response to cellular oxidative stress[J].Mol Cell Bio, 2006, 26(20): 7430-7436.

[21]KUMAR A, PANT M C, SINGH H S, et al.Reduced expression of DNA repair genes (XRCC1, XPD, and OGG1) in squamous cell carcinoma of head and neck in North India[J].Tumour Biol, 2012,33(1): 111-119.

[22]FORKERT P G, MILLEN B, LASH L H, et al.Pulmonary bronchiolar cytotoxicity and formation of dichloroacetyl lysine protein adducts in mice treated with trichloroethylene[J].J Pharmacol Exp Ther, 2006,316(2): 520-529.

[23]GONZALEZ fJ.Role of cytochromes P450 in chemical toxicity and oxidative stress: studies with CYP2E1[J].Mutat Res, 2005, 569(1/2):101-110.

[24]BAI J, CEDERBAUM A I.Overexpression of CYP2E1 in mitochondria sensitizes HepG2 cells to the toxicity caused by depletion of glutathione[J].J Biol Chem, 2006, 281(8): 5128-5136.

[25]KIM S S, HA J H, JEONG M H, et al.Comparison of biological activities of fermented codonopsis lanceolata and freshCodonopsis lanceolata[J].Korean J Medicinal Crop Sci, 2009,17(4): 280-285.