表面增强拉曼散射标记免疫检测的再生性研究

祁妍华

拉曼光谱是在分子水平上研究物质结构的一种重要的工具，已广泛应用于分析科学领域[1]，表面增强拉曼光谱克服了普通拉曼光谱检测灵敏度低的缺点[2]，是灵敏度较高的研究界面效应的技术之一，能最大限度地应用于研究吸附分子在表面的取向及吸附行为、吸附界面表面状态、生物大分子的界面取向及构型、构象和结构分析[3]。在商品化的实际应用中，需要强调产品的可再生利用性，需采用真正可行的抗体抗原分离方式，同时不影响抗体抗原的活性与特异性[4]。

在以上理论的基础上，本实验在SERS检测中引入合适的生物洗脱体系——甘氨酸-HCI缓冲体系，以探究本方法的洗脱效果、稳定性和重复使用性。

1 材料与方法

1.1 材料 用Frens法制备得的金溶胶，粒径大约30～40 nm。浓度1 mmol/L的苯硫酚和浓度1 mmol/L的4，4’-联吡啶分子溶液。3.34 mg/L的羊抗人IgG。小牛血清白蛋白（BSA）（5%p）。pH 9的硼砂缓冲溶液。美国Full Moon BioSystems公司的生物芯片。TBS/0.1%Tween、TBS和三次水。

1.2 方法

1.2.1 制备金溶胶作免疫标记 用Frens法制备得到紫红色浑浊的金溶胶，粒径大约30～40 nm。将浓度1 mmol/L的苯硫酚1 μl和浓度1 mmol/L的4，4’-联吡啶0.4 μl两种标记分子溶液分别加入金溶胶中做标记，同时对标记溶胶进行多次离心，之后重新悬浮，以去掉多出来的标记分子。把3.34 mg/L的羊抗人IgG 5 μl加进标记溶胶中，在室温下充分反应后，对标记溶胶再次离心，使其悬浮。选择5%p的BSA即小牛血清白蛋白把表面的空位进行封闭，然后离心，在硼砂缓冲溶液（pH 9）的作用下，再实现溶胶的悬浮。

1.2.2 制作固相抗体 抗体使用的稀释液是硼砂缓冲溶液（pH 9），稀释的浓度以每毫升200～500 μg为宜，之后把稀释好的液体滴在美国Full Moon BioSystems公司的生物芯片所做的固相基底上，形成拉曼光谱的采集点。环境湿度维持65%～75%，把上面所制作好的芯片放入，12 h后拿出，然后放在普通室温中，干燥0.5 h。

1.2.3 组装三明治结构的复合物和进行SERS检测 把之前制得的抗体分别在BSA溶液（5%）中、人抗原的缓冲溶液中和标记免疫金溶胶溶液振荡0.5 h、2～4 h和2 h，在每次震荡后分别用三次水以及TBS/0.1%Tween、TBS和三次水依次冲洗，再分别用氮气吹干。制得“固相抗体-待测抗原-标记免疫金溶胶”，它是三明治结构的复合物，可以用该抗体来进行SERS检测。

1.2.4 仪器 使用的仪器与设备有LEO-1530型扫描电子显微镜、法国Jobin Yvon公司的HR800共聚焦激光拉曼散射仪、He-Ne激光器、电荷耦合检测器和100倍的长焦镜头物镜。

1.2.5 选择洗脱体系 先用人抗原和羊抗人抗体制备抗原和抗体的复合物，第一次选择强酸的盐酸溶液（pH 2）进行洗脱，让基底在强酸溶液中震荡，震荡2 h，把4，4’-联吡啶作为免疫标记分子，第二次组装三明治结构的复合物，用来进行SERS检测，观察SERS谱图。在看到生物缓冲体系的作用后，采用甘氨酸-HCI（0.2 mol/L）生物缓冲体系，调节体系的pH 值，使pH为2，再把已制备好三明治夹心结构的基底浸入其中。观察洗脱之前、洗脱5 h、洗脱10 h、洗脱24 h后测得的SEM图。

1.2.6 洗脱后基底的稳定性 选择羊抗人抗体抗原和苯硫酚，把后者作为标记分子，制备抗原抗体复合物。然后再用用甘氨酸-HCI体系对复合物洗脱，分别在暗处放置在10 d、1个月、2个月后，第二次制备三明治结构。分析经过静置再次组装的三明治结构SERS谱图。

1.2.7 观察载体的重复使用性 洗脱基底1、5、10次，再分别进行组装，第二次抗原检测以苯硫酚作为免疫检测标记分子，通过分析之后的SEM图来研究基底的可重复使用次数。

2 结果

首先通过改变pH值来试图解离抗体抗原复合物，把洗脱2 h之后第二次组装的三明治夹心结构复合物进行SERS检测，谱图上显示有3个样点有明显的标记分子信号。洗脱后预期目的已基本达到，但是在少部分区域出现与标记分子4，4’-联吡啶特征峰不一样的杂峰和比较复杂的谱峰。该结果提示，只有强酸体系解离复合物并不利于维持生物环境。因此，分离的高选择性和彻底性和保护体系生物活性的重要性是SERS检测可再生性的关系因素，而使用生物缓冲体系后，既能防止pH变化对提取效果的影响，又能防止因pH值变化过度而导致的某些活性物质的变性。

之后采用甘氨酸-HCI（0.2 mol/L）生物缓冲体系进行洗脱，通过洗脱之前、洗脱5 h、洗脱10 h、洗脱24 h后测得的SEM图进行分析得知，洗脱时间的选择与抗体抗原分离的彻底性密切相关，且在洗脱时间为24 h时，抗原和抗体能充分分离，因此清除了抗体上的标记免疫溶胶和抗原，洗脱效果较好。

把洗脱后的基底分别静置在阴暗处10 d、1个月、2个月后，第二次制备抗原抗体复合物。通过分析处理后二次制备的复合物SERS谱图，可见a1振动模式特征谱峰在999和1 573 CTn-1的位置，而具有苯硫酚特征的峰值清晰。

洗脱基底重复1、5、10遍，然后再分别组装，这一过程的SEM图中，基底上的纳米粒子和洗脱基底再组装的次数呈反比，这与基底活性点被洗脱次数增加有关。基于上述结果，第二次抗原检测以苯硫酚作为免疫检测标记分子，基底洗脱后再组装的次数增加，可达10次左右。在这一过程的SERS谱图上，挑选重复1、5、10次的谱图，这些图谱在1000～1600/cm处具有分辨率不良的、较复杂的杂质峰。

3 讨论

自从1974年Fleisehmarm发现吡啶的表面增强拉曼散射光谱（SERS）以来，SERS已经逐渐成为一种研究物质结构性质的快速有效的手段[5]。SERS标记免疫检测是将SERS与标记免疫学相结合，利用SERS的高灵敏度和光谱选择性，结合抗体抗原的特异反应作用而进行的纳米标记免疫分析技术[6]，能避免溶液中类似物质的信号干扰，从而轻易获取高分辨的表面分子信号[7]，由于具有高灵敏度、快捷、方便等特点[8]，SERS标记免疫检测已被广泛用于表面科学相关的领域，其应用领域的有效拓宽直接与活性基底的制备和增强机理的研究密切相关[9]，SERS免疫检测已逐渐有成为新的免疫技术的趋势[10]。

本次研究中，对抗原抗体复合物采用的洗脱的方式选择的是甘氨酸-HCl缓冲体系，在洗脱1 d后，抗原和抗体能充分分离，因此清除了抗体上的标记免疫溶胶和抗原。优良的再生效果体现在复合物在经过重新组装后，识别标记分子从而进行SERS检测的能力不变，仍能使用的次数大约为10次。经过本研究的实验结果证明，通过甘氨酸-HCI生物缓冲体系洗脱是一种洗脱基底再生效果好和稳定性强的方法。

[1]汪佳俐，曹晓卫，李欣然，等.胱氨酸与半胱氨酸混合体系拉曼光谱的化学计量学解析[J].光谱学与光谱分析，2010，30（11）：243-244.

[2]鲍芳.过渡金属核壳纳米粒子的制备及其表面增强拉曼光谱研究[D].苏州大学博士学位论文，2009.

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