AQP4与星形胶质细胞胀亡之间的关系

黄鹤鸣 褚晓凡

暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院神经内科，广东深圳 518020

脑缺血后神经元凋亡的机制及引起凋亡的两条细胞信号传递路径（线粒体路径及受体介导路径）已经被证实。然而作为脑组织的主要组成成分，脑缺血后胶质细胞的损伤机制及死亡路径尚未得到足够的重视。这些星形胶质细胞广泛分布于灰质、白质中，对于维持神经系统正常功能起到重要作用。因此明确脑缺血后星形胶质细胞通过什么方式和途径死亡十分重要，能够为通过保护星形胶质细胞来保护神经元的治疗方案提供参考，会给脑缺血后神经保护带来意外的收获。

1 胀亡（Oncosis）

目前将细胞死亡主要分为两类，一是细胞凋亡（apoptosis），另一类被称作偶然性细胞死亡（accidental cell death）[1]。紊乱的自体吞噬代表在器官重塑及某些特定的病理过程中的第三种细胞死亡方式。Majno及Joris等提议除了细胞凋亡之外，大部分情况下的细胞死亡比较贴切的描述应该是偶然性细胞死亡，即“胀亡”，因为这种细胞损伤及死亡伴随着细胞肿胀。Trump曾经对细胞凋亡、胀亡及坏死进行系统性描述[2]。细胞坏死是细胞死亡后所发生的一系列分解反应，是细胞的一种不可逆改变，主要包括核溶解、核固缩、核破裂、核结构丧失及细胞内碎片形成。而凋亡及胀亡是细胞死亡之前的反应性表现，是细胞的两种死亡方式。凋亡及胀亡的主要区别在于细胞的体积、膜形态，细胞进入凋亡还是胀亡与所在组织的ATP水平有关[3]。在细胞凋亡的过程中，细胞皱缩，胞突或者生泡，但是细胞膜的通透性保持不变，细胞核裂解，细胞核染色质凝集，最终细胞碎裂成多个凋亡小体[1]。胀亡与细胞能量耗竭有关，有研究发现轻度解偶联蛋白2（UCP-2）表达的增加会导致急剧的线粒体膜电位下降，细胞内ATP的合成减少，此时细胞膜离子泵功能丧失，水及离子进入细胞内，细胞肿胀，内质网及高尔基体扩张，线粒体肿胀后凝集，核染色质结块，形成游离细胞器形成的胞质泡，最终细胞胀亡[1-4]。有研究指出，胀亡，如同凋亡一样，可以通过细胞表面受体被激活，比如PORIMIN受体[5]。这两种死亡方式均是提前被编码好的，遗传信息、相关酶和很多其他因素提前存在于细胞中。最近关于细胞损伤及死亡的研究指出在不可逆性细胞损伤的末期胀亡占主导地位[6]。我们的研究发现在同一个病灶中，细胞胀亡和凋亡可同时出现并表现出一定的分布特征，血液供应相对充足部位由于能量相对富足因此凋亡多见，而血供缺乏的区域则细胞胀亡多见。脑缺血中心区细胞以胀亡为主，周边区以凋亡为主[7]。

胀亡是指致命性细胞损伤如缺血或许多化学毒素中毒之后的细胞死亡前期状态[1]。有人提出胀亡性细胞死亡主要包括3个时期：在第一个时期，细胞主要因选择性膜损伤开始进入胀亡过程，由于ATP合成障碍导致细胞能力耗竭，离子泵功能丧失，水和离子进入细胞内，导致细胞肿胀，但是在这一时期，细胞膜的通透性并没有发生改变。在第二个时期，细胞损伤变的不可逆，此期碘化物及台盼蓝能够通过细胞膜，意味着发生了非选择性的细胞膜通透性改变。在第三个时期，细胞最终出现膜物理性崩解，即发生了细胞坏死[4]。由于胀亡伴随着细胞内外水平衡的破坏，故胀亡与调节水平衡的水通道之间的关系密不可分。近几年来，越来越多的研究对细胞胀亡的发生进行了报道，比如：动脉硬化斑块中的细胞死亡[8]，由于放射导致的细胞死亡[9]，由于缺血性心脏病及脑卒中导致的细胞死亡等[10]。我们之前的研究显示持续局灶脑缺血中心区域星形胶质细胞的死亡方式也是胀亡，其是以细胞肿胀和核溶解为特征的一种细胞死亡过程[11]。

2 星形胶质细胞的胀亡

在大脑中，星形胶质细胞的数目是其他神经元数目的5倍以上，星形胶质细胞在中枢神经系统中有重要的作用。包括维持细胞外离子及水平衡，协助神经递质的传递及代谢，组成血脑屏障，参与大脑的修复过程等[12-13]。当严重的脑缺血发生时，血脑屏障及内皮细胞功能紊乱会导致星形胶质细胞肿胀，激活兴奋性氨基酸（excitatory amino acid，EEA）的释放，诱导星形胶质细胞死亡。因此，阻止星形胶质细胞膨胀或EAA的释放已经成为神经保护的靶点[14]。

有很多研究报道在脑缺血早期出现星形胶质细胞肿胀的现象。但是，这些肿胀的星形胶质细胞的命运及最终死亡通路目前并不明确，对于脑缺血后的星形胶质细胞死亡通路究竟是凋亡还是胀亡存在很多不同的观点。在培育的星形胶质细胞中，有人认为缺血会诱导凋亡[14]。在活体实验中，在大鼠脑一过性缺血后，在电镜下很少能够观察到凋亡星形胶质细胞的存在[15]。有研究发现在培育的星形胶质细胞中，剥夺氧供及葡萄糖后，由于血脑屏障及内皮细胞功能的损害出现星形胶质细胞胀亡[16]。但是Gabryel及其同事持有不同的意见，他们认为在脑缺血之后的几秒钟内观察到的星形胶质细胞肿胀实际上是胶质细胞增殖的早期现象，反应性星形胶质细胞呈星形，GFAP免疫应答性增加，伴随着线粒体数目增加以及酶介导的、非酶介导的抗氧化活动增强。Ito及其同事将缺血后星形胶质细胞肿胀看做细胞维持内、外环境稳定能力的紊乱[17]。在2003年时，有人提出脑缺血导致的神经细胞死亡可能与胀亡有关。采用颈内动脉线栓环扎法建立大鼠持续局灶脑缺血模型，观察到在脑组织中无论是缺血中心区还是缺血边缘区星形胶质细胞都是以肿胀为主[18]。缺血后3 h，缺血区星形胶质细胞核周边区域发生异染色聚集，核膜完整性的破坏，缺血12 h后出现染色质的渗漏。Majno及Joris曾经描述胀亡的标志性表现是胞浆及细胞核肿胀，胞浆内细胞器官的破裂及核溶解，而且胀亡常由缺血及毒性物质引起，我们研究在持续局灶脑缺血中心区域发现星形胶质细胞的缺血性死亡形态学特征类似胀亡，这意味着胀亡可能是缺血性星形胶质细胞的死亡通路[11]。随后，我们的实验中星形胶质细胞行缺糖缺氧 （oxygen glucose deprivation，OGD）后，其Na+-K+-ATP酶活性随OGD时间的延长而降低，流式细胞仪测的胀亡细胞比率则随OGD时间的延长而增多。可见胀亡细胞比率随Na+-K+-ATP酶活性降低而升高。前期研究已发现，星形胶质细胞的ATP随OGD时间的延长而逐渐下降，胀亡比率明显升高，在ODG 3 h内胀亡比率小于凋亡，3 h起逐渐超过凋亡，成为星形胶质细胞的主要死亡方式[19]。

3 APQ4及星形胶质细胞

水通道蛋白（Aquaporins，AQP）是胞膜上控制细胞水含量的蛋白。1991年，在红细胞中发现了第一种水通道蛋白，目前已发现了位于不同部位的13种AQPs[20]。水主要在跨膜溶质浓度梯度的驱动下通过AQPs进行转运。转运的速率主要取决于单个通道的水通透性及胞膜上AQPs的位置及数量。AQP1、2、4、5、8 只对水有通透性，而 AQP6 还能允许Cl离子通过。AQP3、7、9、10允许甘油及可溶于水的小分子通过。AQP0、11、12的通透性至今仍不明了。在大脑中存在AQP1、4、9。AQP1位于脑室系统的脉络丛中，主要参与脑脊液的产生。AQP9主要参与大脑的能量代谢，存在于星形胶质细胞及一部分神经元中。大脑中最多的水通道蛋白是AQP4，AQP4是一种只有30-kDa的疏水跨膜蛋白，是维持大脑水平衡的重要水通道蛋白，水主要在跨膜溶质浓度梯度的驱动下通过AQP4进行转移。AQP4在脑水肿，癫痫，肝性脑病及脑肿瘤的病理生理过程中有重要的作用。由于AQP4主要在星形胶质细胞中表达，而且水转移的速度主要由星形胶质细胞上调或下调AQP4的表达，改变其在胞膜的位置及改变其通透性决定的，这使星形胶质细胞成为研究很多神经系统疾病及探索治疗这些疾病的新方案的靶点细胞。在星形胶质细胞中，AQP4主要在3个重要部分表达比较密集：血管周围星形胶质细胞足突，在血脑屏障功能中有重要作用；在突触周围星形胶质细胞足突，在神经递质的清除中有重要作用；与郎飞结及无髓鞘轴突接触的足突，在K+的清除中有重要作用。血管周围的星形胶质细胞足突是大脑内AQP4表达的主要位置[21]。

脑水肿分子学机制的基础由Igor Klatzo提出，他将水肿分为两大类，细胞毒性水肿及血管源性水肿，其中细胞毒性水肿与细胞胀亡密切相关[22]。如同在低钠血症及早期脑缺血中所见，细胞毒性水肿是由于能量耗竭导致细胞内水堆积及细胞失去调节其体积的能力。这使水从细胞间隙进入细胞，从血液进入脑实质。星形胶质细胞是在细胞毒性水肿过程中肿胀的主要细胞类型，星形胶质细胞肿胀也是脑水肿的重要早期状态。

星形胶质细胞中表达的AQP4在脑缺血、脑外伤、肿瘤、炎症及代谢障碍导致的脑水肿中有重要作用。AQP4在细胞毒性水肿中的重要作用的依据主要来自于AQP4基因沉默的小鼠中。腹膜内注射水会在5 min内产生严重低钠血症，随后小鼠即因脑肿胀及颅内压增高而死亡。而在AQP4基因沉默的小鼠中低钠血症导致死亡的比率显著下降。这种保护作用与血脑屏障水通透性下降及进入脑实质的水的比率下降有关。AQP4基因沉默的小鼠对其他类型的细胞毒性脑水肿易感性也较低，如细菌性脑膜炎[23]。胞浆膜上的AQP4蛋白与聚集的细胞内蛋白绑定，如α-肌氧结合蛋白。有趣的是，α-肌氧蛋白基因沉默的小鼠也不易发生局灶性脑缺血引起的脑水肿[24]。上述研究提示抑制AQP4表达或功能的药物能够限制人类细胞毒性脑水肿。但是，AQP4基因敲除会使血管源性脑水肿加剧。在细胞毒性水肿中，AQP4基因敲除会使水进入大脑的速率降低，但是在血管源性水肿中，AQP4敲除还会使水从大脑中转移出的速率下降。因此，AQP4在转基因小鼠中过度表达会加剧细胞毒性脑肿胀[25]。

4 AQP4的调节

大脑内AQP4的位置及数量都被紧密调节。交互作用蛋白，缺氧，渗透压改变，氨及转录信息均可以对AQP4进行长期调节；AQP4的短期调节主要依赖于受体，大部分都是G蛋白偶联的胞膜受体，这些受体的激活剂包括肽类激素、类前列腺素、儿茶酚胺及氨基酸，受体及配体相互作用后发生磷酸化及去磷酸化。

有研究表明缺氧被认为能够影响星形胶质细胞的AQP4表达。冠状动脉阻塞，导致全脑缺氧，据报道缺氧/缺血24 h后，会出现AQP4表达下降[26]。在大脑中动脉阻塞过程中，尤其在有血管性损伤的部位，氧供没有恢复的区域，AQP4的表达会快速下降[24]。但是，当细胞再次获得氧供时，AQP4表达的下调可以被逆转，再度给氧9～12 h后，出现AQP4的明显表达增加[27]。在新生的动物中，短暂的3.5 min的窒息之后给氧6 h会出现全脑的AQP4表达下降[28]。而成年大鼠系统性缺氧2 h随后恢复氧供9 h，会产生脑干AQP4表达增加[29]。对卒中后死亡的患者进行尸检发现，缺血灶周围星形胶质细胞AQP4表达增加[30]。在体内试验中，缺氧对AQP4表达的作用不仅基于缺氧的范围及程度，还与重新获得氧供的范围、重新获得氧供的时间有关。这也许能够解释不同的缺氧模型中，如卒中，窒息或TBI中AQP4表达的差异。

5 结论

众所周知大脑内水平衡主要通过水通道蛋白进行调节，而AQP4是星形胶质细胞主要的水通道蛋白，所以AQP4与星形胶质细胞的胀亡有必然的联系。缺血缺氧，使AQP4的表达发生改变，最终导致星形胶质细胞内外水平衡被破坏，发生细胞胀亡。AQP4在细胞毒性水肿有重要的作用，AQP4究竟如何改变而导致星形胶质细胞胀亡均有待进一步研究，能够为治疗脑缺血等疾病的治疗发现新的靶点。

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