ITPA基因变异与干扰素联合利巴韦林治疗过程中发生贫血的相关性

王茉莉 潘 煜 姜 晶 迟秀梅 李婉玉 姜 涛 张 洪 牛俊奇

(长春一汽总医院 吉林大学第四医院感染科，吉林 长春 130011)

ITPA基因变异与干扰素联合利巴韦林治疗过程中发生贫血的相关性

王茉莉 潘 煜1姜 晶1迟秀梅1李婉玉1姜 涛2张 洪1牛俊奇1

(长春一汽总医院 吉林大学第四医院感染科，吉林 长春 130011)

目的探讨C20orf194基因rs6051702位点和ITPA基因rs1127354位点与慢性丙型肝炎治疗过程中利巴韦林引起的溶血性贫血之间的相关性。方法入选慢性丙型肝炎患者742例、健康人群203例，提取上述两组人群的基因组DNA进行两个位点的焦磷酸测序;对208名慢性丙型肝炎患者进行干扰素联合利巴韦林抗病毒治疗，并在抗病毒治疗的基线、2 w、4 w、12 w对患者进行血常规、HCV RNA定量检测。用SAS9.0软件进行分析。结果(1)我国健康人群rs6051702及rs1127354位点的最小等位基因频率分别为15.3%、15.8%，与欧洲和日本接近，但水平略低。(2)2、4、12 w血红蛋白下降量与rs1127354位点的不同基因型的关系有统计学意义(均P＜0.05)，A等位基因具有保护作用。(3)2、4、12 w血红蛋白下降量与rs6051702位点的不同基因型的关系无显著差异(均P＞0.05)。(4)rs1127354位点4 w血红蛋白降低超过3 g/dl的CC组与AC+AA组存在差别(P=0.001)。结论(1)rs6051702位点、rs1127354位点在慢性HCV感染者、健康人群之间没有显著差异。(2)rs6051702位点与抗HCV治疗过程中血红蛋白下降量无相关性。(3)ITPA基因rs1127354位点与抗HCV治疗过程中血红蛋白下降量呈明显相关，含A等位基因(AC和AA型)的患者贫血程度较CC型的低，提示A等位基因为保护基因，可用来预测患者抗HCV治疗过程中血红蛋白下降的程度，并指导早期调整利巴韦林剂量。

慢性丙型肝炎;利巴韦林;溶血性贫血;单核苷酸多态性;ITPA基因

近期有研究表明，在欧裔美国人、美国黑人和白人慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染者中第20号染色体上C20orf194基因的rs6051702位点和三磷酸肌苷焦磷酸酶(ITPA)基因中的rs1127354位点的变异直接与利巴韦林治疗慢性丙型肝炎病人4 w时血红蛋白(HGB)下降程度密切相关〔1，2〕。日本的两个研究证实在日本人群中ITPA基因遗传变异能够保护性抑制利巴韦林引起的溶血性贫血，其中rs1127354位点被确认为利巴韦林治疗诱发溶血性贫血的最有效的预测因子，A等位基因为保护性基因，同时发现C20orf194基因的rs6051702位点和利巴韦林治疗后HGB水平降低有关〔3，4〕。目前国内尚没有关于ITPA基因与干扰素(INF)联合利巴韦林治疗中贫血发生关系的报道。本研究拟明确我国北方人群中C20orf194基因和ITPA基因的等位基因频率及基因型分布，探讨C20orf194基因和ITPA基因多态性位点与慢性丙型肝炎治疗过程中利巴韦林引起的溶血性贫血之间的相关性，找到利巴韦林治疗引起溶血性贫血的预测因子。

1 材料与方法

1.1 对象 慢性丙型肝炎患者742例，来自丙型肝炎流行地区。健康人群203人。对742名慢性丙型肝炎患者进一步检查，有208例患者签写知情同意书后进行INF联合利巴韦林抗病毒治疗。治疗方案为INF-α500万U隔日一次皮下注射、利巴韦林900 mg每日口服，并在抗病毒治疗的基线、2 w、4 w进行血常规、HCV RNA定量检测。其中有50例因不能保持较好的依从性，实际服用剂量低于治疗剂量的80%，从本实验数据中筛除，余158例患者最后进入统计学分析。其中男106例(67.1%)，年龄49(45～56)岁，基线体重65(58 ～70)kg，体重指数22.6(21.1～24.8)kg/m2，HGB 15.5(13.6 ～16.0)g/dl，血小板(PLT)167(132～200)×109/L，白细胞(WBC)5.70(4.7～6.8)×109/L，中性粒细胞3.4(2.6～4.0)×109/L，红细胞4.8(4.4～5.2)×1012/L，HCV RNA 6.3(5.4～6.7)log转换。

慢性丙型肝炎的诊断标准及治疗适应证均根据2004年中华医学会肝病学分会制定的《丙肝防治指南》中的规定。

1.2 主要试剂和仪器 离心柱型血液基因组DNA提取试剂盒(北京天根生物有限公司);全自动凝胶成像分析仪(上海培清生物科技有限公司);Roche COBAS®AmpliPrep®/TaqMan®全自动荧光定量PCR仪(美国);ABI7300荧光定量PCR仪(ABI公司);HCV RNA检测试剂盒(罗氏分子系统，美国);血球分析仪BCC-3000B(长春迪瑞实业有限公司)。

1.3 基因组DNA的提取 采用离心柱方法提取全血基因组DNA，按照说明书进行操作。采用全自动凝胶成像分析仪分析DNA含量，从NCBI(美国国立生物技术信息中心)的单核苷酸多态性(SNP)数据库中查到SNP rs6051702的序列:AACTCACCATATAACAGGGGTTATTC〔A/C〕TTATATCCTCAAAGAGTGCACTGCC;SNP rs1127354的序列:TCGTTCAGATTCTAGGAGATAAGTTT〔A/C〕CATGCACTTTGGTGGCACAGAAAAT，利用焦磷酸测序的方法对该位点进行检测。

1.4 血常规检测 采集外周抗凝血2 m l，应用血球分析仪进行三分类检测，检查项目包括白细胞、红细胞、HGB、血小板等。

1.5 统计学方法 应用SAS9.0统计软件进行分析，使用χ2分析中的拟合优度检验进行哈迪温伯格遗传平衡检验(HWE)，利用χ2检验、非参数秩和检验、配对T检验进行数据统计。计量资料如若不符合正态分布，则以中位数(四分位区间)表示。

2 结果

2.1 SNP rs6051702等位基因频率和基因型频率 SNP rs6051702位点检测基因型为AA、AC及CC三种。遗传平衡检验显示，病例组与对照组均符合哈迪温伯格遗传平衡定律(P＞0.05)。慢性HCV感染人群和健康人群基因型比较差异无统计学意义(χ2=3.497，P=0.17)，等位基因频率比较也无统计学差异(χ2=0.000 4，P=0.98)。见表 1。

表1 两组SNP rs6051702基因型及基因频率比较〔n(%)〕

2.2 SNP rs1127354等位基因频率和基因型频率 SNP rs1127354位点检测基因型为CC、AC及AA三种。遗传平衡检验显示，病例组与对照组均符合哈迪温伯格遗传平衡定律(P＞0.05)。慢性HCV感染人群和健康人群基因型(χ2=0.861，P=0.65)及等位基因频率(χ2=0.328，P=0.57)比较差异均无统计学意义。见表2。

表2 两组SNP rs1127354基因型及基因频率比较〔n(%)〕

2.3 158例慢性丙型肝炎病人治疗后HGB下降程度 对158名患者进行2、4、12 w的回访(分别有10、6、15人未参与相应的回访工作，其对应的检查结果缺失)，2、4、12 w HGB平均下降1.3(0.2～2.5)、1.7(0.8～3.0)、1.1(0 ～2.3)g/dl，严重贫血发生率分别为 13/148(8.8%)、8/152(5.3%)、4/143(2.8%)。

2.4 C20orf194基因rs6051702位点不同基因型与HGB下降的关系 158例患者 AA、AC、CC基因型分别为 113例(71.5%)、43例(27.2%)、2例(1.3%)。2 w时AA组HGB下降1.30 g/dl，AC+CC组 HGB降低1.45 g/dl;4 w时 AA组HGB下降1.70 g/dl，AC+CC组降低1.45 g/dl;12 w时AA组HGB下降1.30 g/dl，AC+CC组降低0.85 g/dl。三个位点均P＞0.05，提示两组无显著差异，rs6051702位点不同基因型与HGB下降量没有明显的联系。

2.5 ITPA基因rs1127354位点不同基因型与HGB下降的关系 158例患者CC、AC、AA基因型分别为133例(84.2%)、21例(13.3%)、4例(2.5%)。2 w时CC组HGB下降1.60 g/dl，AC+AA组HGB升高0.4 g/dl;4 w时CC组HGB下降2.00 g/dl，AC+AA组降低0.7 g/dl;12 w时 CC组 HGB下降1.30 g/dl，AC+AA组降低0.6 g/dl。三个位点均 P＜0.05，提示不同基因型组间的差异有统计学意义，含次要等位基因A的AC+AA组HGB下降量低，A等位基因具有保护性抑制贫血的作用。

2.6 4 w时两个SNP位点不同基因分型HGB降低超过3 g/dl、严重贫血(HGB＜10 g/dl)的分析结果 C20orf194基因rs6051702位点HGB降低超过3 g/dl的AA组25例(22.7%)，AC+CC组14例(33.3%)，二者没有差别(P=0.18);HGB水平低于 10 g/dl的 AA组 4例(3.6%)、AC+CC组 4例(9.5%)，二者没有差别(P=0.14)。ITPA基因rs1127354位点HGB降低超过3 g/dl的CC组39例(30.5%)，AC+AA组0例，二者存在差别(P=0.002);HGB水平低于10 g/dl的AA组7例(5.5%)，AC+CC组1例(4.2%)，二者没有差别(P=0.79)。

3 讨论

欧美人rs6051702位点的最小等位基因频率(MAF)19.4%、日本人MAF 19.9%，本研究与欧洲和日本接近，但水平略低。欧美人rs1127354位点的MAF为7.6%、日本人MAF为14.2%，本研究与日本近似，与欧美人差距相对大。

本研究结果显示，C20orf194基因上的rs6051702位点与2、4、12 w HGB下降量无相关性，且不同基因型与HGB下降超过3 g/dl及严重贫血无相关性。而rs6051702位点在欧美人群中与4 w时HGB下降表现了显著的相关性(P=1.1×10－45)〔1〕。日本Sakamoto等〔4〕的研究中，rs6051702位点与HGB下降量表现轻度的相关性〔odds ratio(OR)=1.40，P=9.0 ×10－3〕。这种差异可能是由于基因的连锁不平衡(LD)在亚洲处于低水平所致。据报道，该C20orf194基因的rs6051702位点在不同种族之间与HGB降低的关系也存在差异，非洲裔人P=0.19，西班牙人 P=9.5 ×10－3〔1〕。

本研究通过非参数秩和检验，发现ITPA基因上的rs1127354位点与2、4、12 w HGB下降量存在明显相关性，提示rs1127354位点的遗传变异与HGB下降量相关，AA+AC组平均HGB下降量低于CC组，提示rs1127354位点可用来预测患者接受利巴韦林治疗后引起的溶血性贫血。而含有A等位基因的患者贫血出现的概率小，A等位基因为保护性基因，这与文献报道一致〔1～4〕。

4 w时rs1127354位点的CC基因型中有69.5%的病人没有出现明显贫血，考虑可能存在其他一些低频率的ITPA基因的SNP或细胞中存在其他酶类对利巴韦林引起的溶血性贫血具有保护作用。其中中国北方慢性丙型肝炎rs1127354位点CC型病人抗病毒治疗4 w时HGB降低超过3 g/dl的占30.5%，明显低于欧美人的 48.4%〔1〕和日本人的48.7%〔4〕，原因考虑为:(1)样本量相对小;(2)患者的依从性影响治疗效果，且利巴韦林引起的溶血性贫血是剂量依赖的、可逆的，总体剂量的减少必然引起贫血出现概率降低;(3)不同种族及人群影响利巴韦林引起溶血性贫血的发生率。

本研究中的患者跟踪到12 w，尚未涉及到24 w、48 w后治疗结果的部分，没有对SNP位点的遗传变异与治疗结果的关系进行研究。在INF联合利巴韦林抗病毒治疗的过程中，病人保持良好的依从性是非常重要的，这样可保持较好的治疗应答。在美国〔5〕和日本〔6〕的研究中证实增加利巴韦林用量可提高患者的持续病毒应答(SVR)。Thompson等〔2〕的研究表明 ITPA遗传变异与SVR存在明显的相关性，而Sakamoto等〔4〕的研究中发现ITPA遗传变异与抗病毒治疗的效果的相关性不明显，分析原因考虑与患者的年龄及肝脏纤维化程度的影响有关。这些有待在中国人群中进一步检验和认证。

1 Fellay J，Thompson AJ，Ge D，et al.ITPA gene variants protect against anaemia in patients treated for chronic hepatitis C〔J〕.Nature，2010;464(7287):405-8.

2 Thompson AJ，Fellay J，Patel K，et al.Variants in the ITPA gene protect against ribavirin-induced hemolytic anemia and decrease the need for ribavirin dose reduction〔J〕.Gastroenterology，2010;139(4):1181-9.

3 Ochi H，Maekawa T，Abe H，et al.ITPA polymorphism affects ribavirininduced anemia and outcomes of therapy-A genome-wide study of Japanese HCV virus patients〔J〕.Gastroenterology，2010;139(4):1190-7.

4 Sakamoto N，Tanaka Y，Nakagawa M，et al.ITPA gene variant protects against anemia induced by pegylated interferon-a and ribavirin therapy for Japanese patientswith chronic hepatitis〔J〕.Hepatol Res，2010;40(11):1063-71.

5 McHutchison JG，Lawitz EJ，Shiffman ML，etal.Peginterferon alpha-2b or alfa-2a with ribavirin for treatment of hepatitis C infection〔J〕.N Engl J Med，2009;361(6):580-93.

6 Hiramatsu N，Oze T，Yakushijin T，et al.Ribavirin dose reduction raises relapse rate dose-dependently in genotype 1 patients with hepatitis C responding to pegylated interferon alpha-2b plus ribavirin〔J〕.JViral Hepat，2009;16(8):586-94.

R512.63

A

1005-9202(2013)12-2759-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2013.12.011

1 吉林大学第一医院肝胆胰内科 2 吉林省肝胆病医院

牛俊奇(1958-)，男，教授，博士，博士生导师，主要从事病毒性肝炎研究。

王茉莉(1980-)，女，硕士，医师，主要从事病毒性肝炎的分子生物学研究。

〔2012-10-11收稿 2013-01-02修回〕

(编辑 袁左鸣)