DGGE技术在环境微生物多样性研究中的应用

唐玉林

大连大学生命科学与技术学院 116622

近年来，随着我国改革开放的不断深入，我国经济和科技都得到快速发展，并且人们的综合素质水平也得到很大的提升，人们对环境保护的呼声越来越高，且环境保护已经成为国际共同关注的重点话题。而微生物作为环境净化的主要作用者之一，研究和开发新微生物处理技术以及新工艺具有重要的作用和意义。其主要是由于微生物能将有机物质作为营养源转化为组成物质和能量，这些物质能有效吸附污染物，并且能有效降解环境中的污染源。DGGE技术是目前新技术研究的新产物，在环境生物多样化研究中起着重要的作用，具有经济的推广意义。

1 DGGE技术分析

DGGE技术主要是利用具有化学变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶对DNA进行电脉，其主要是由于聚丙烯酰胺凝胶具有将PCR扩增产物有区分的分解开来。一般在使用聚丙烯酰胺凝胶对PDR产物进行变性梯度凝胶电脉分解时，由于长度相同而碱基序列上存在的DNA 双链片段会随着变性剂浓度的增加而在各自发生不同的变化，其空间结构形式也会发生变化。结构形式与浓度变化的关系为结构形式随着浓度的增加而由开始双链DNA向正极移动，DNA中含有低G+C的序列部分就会被拆解开来，但是高G+C含量的部分却仍然保持双链。在电脉过程中，DNA双链一旦发生解链现象，DNA分子形成端部的就会被渐渐的熔化。如果电脉时，聚丙烯酰胺凝胶中的电脉急速下降，直至停止在其相应的不同的变性剂梯度位置时，染色后的DNA会被分开，并且以条状的形状出现，最终能将具有相同长度且有相互区别的DNA分子分离开来。

2 DGGE技术使用的基本工作流程

2.1 基本工作流程

首先，样品预处理。DNA样品提取是DGGE技术在环境微生物多样化研究应用的前提和基础。湿地样品种类很多，这些细菌种类含有大量的有毒物质和腐殖质。而如何有效的提取DNA样品直接决定着研究效果，一般DGGE技术取样分为直接取样法和间接取样化。其中直接取样法就是在土壤中直接裂解微生物体，然后从微生物中提取DNA，这种取样法就是将微生物悬浮在裂解缓冲中处理，提取释放的DNA，然后还要提炼，确保试验样品的纯度。直接取样有SDS高盐提取法和SDS酚氯伤抽取法，前者的主要优势在于提取效率高，而SDS酚氯抽提的效率比较低，并且会造成DNA分子不完整。但是SDS酚氯提取也有优势，这种提取方法中含有的多腐殖酸等杂质，经过纯化后就可以用于研究。另一种间接提取的方法就是将微生物细菌与土壤分开来，然后再提取DNA，这种方法提取的纯度很高，片段完整，并且能直接用于后续一般的操作。间接提取方法比直接提取方法的效率要高，并且细胞分离的效果好。

其次，PCR的扩增及偏差和优化，这一个步骤是整个研究中最重要的部分，其主要采用16S DNA中的保护区作为引物进行PCR反应。采用16S DNA的重要原因是序列分子比较短，比较适应于分类学科的研究。再者，16S DNA是原核生物的主要成分，成分很稳定，在不同阶段基因变化的情况比较小，表现得很保守。并且这种16S DNA都具有自身基本的资料库，然后通过将提取的样品预数据库中的进行对比，最终得出结果。目前被广泛应用到微生物多样性研究中的16S DNA主要有338f/518r（V3区）以及341f/926r(V3-V5区)等。PCR技术的特点就是高温变性、低温退火以及常温延伸等，这三个方面是主要使用的结构，主要是将特异耐热酶TaqDNA中的聚合酶经过受热发生反应，然后DNA分子会沿着模板方向延伸，将这个过程反复几次，最终能使得DNA中的PCE扩增物的数目上升。一般在试验中，的反映程序为：94!C/S、50!C/S以及72!C/S，一共有33个循环，最后就是延伸阶段。从研究结果可以得知，在任何条件下试验偏离最佳试验条件将导致扩增PCR或者非特异性产物等，这些物质的产生很容易影响试验结果和可靠性。所以，在实验中一定要选择最佳电泳条件。

最后，电泳条件的选择在整合分析过程中是至关重要的部，因此，电泳条件的好坏直接关系着试验研究的直接效果。一般的DGGE技术电泳条件包括变性剂梯度、电泳温度以及时间和显影等方面，这些方面的条件只要能达到相关标准，最终能通过反复的试验确定结果。

3 DGGE技术在环境微生物多样化研究中的应用

3.1 PCR-DGGE技术实现废水电解

废水处理主要是对废水中的微生物群体解耦股的动态变化进行追踪研究，针对两种不同的微生物成分进行对比分析，最终得出理想的实际效果。即在相同条件下对低温细菌种和常温细菌种展开对比分析，观察在不同技术下，常温和低温细菌的动态变化。根据相关实验结果显示，环境对微生物的影响直接决定着微生物群落结构的关键因子的组成结构。某单位利用DGGE技术对湖泊中中的污染的水源提取进行试验，最终结果显示在16S DNA中338f/518r（V3区）以及341f/926r(V3-V5区)PRC扩增，并且在V3区-V5区中存在很多微生物特异性片段，最终使用SDS间接提取的方法，对废水中的微生物结构群进行比对研究，得出在不同阶段和不同时间，微生物结构基本一致，但是优势细菌却不相同。由此说明，水解酸化池的活性污泥微生物多样性受到水深度的影响变化很大，并且其结构也会发生种群散量上均有较大的差异。根据实验结果显示，DGGE技术在废水处理中能净化水中的污泥，讲解废水中的有害杂质，实现废水再利用的理想效果。

3.2 PCR-DGGE技术在土壤微生物研究中的应用

通过运用PCR-DGGE对农田中的土壤微生物进行分析可知，DGGE技术可以对所取用的土壤微生物中不同微生物的16SrRNA基因片段上的V3区DNA扩增片断进行分离。这一应用为DNA片段的鉴定与定性工作提供了良好条件。通过对南极中山站排污口土壤中微生物群落进行DGGE分析得到，该处样品中的微生物组成与周围环境中的微生物不太一样。

3.3 PCR-DGGE技术在膜生物处理中的应用

PCR-DGGE技术可以用来解析膜生物反应器中的微生物，研究它们的群落多样性，而这项技术在膜生物处理中的应用说明在长期的稳定运行以后，会形成各自的特定群落结构。这些群落结构既有优势相同的种群同时也有具备自己独特优势的种群，并且同样的种群在不同的反应器中所获得的优势也不相同，而种群所具备的独特优势则是在不同的水质中经过长时间的演变获得的。利用PCRDGGE技术对生物陶粒反应器中细菌种群的岩体情况分析可知，优势种群的数量与群落结构具有一定的时序动态性，并且微生物的多样性与废水的处理效果有着协同变化的特性。将生物膜和水体微生物之间多样性进行比较以后发现，微生物膜越成熟，微生物群落越稳定，生物膜上面微生物的多样性与水体微生物的多样性相比就会越高。

4 DGGE技术在环境微生物多样化研究中应用的优势与未来展望

DGGE技术目前在实际使用中已经取得一定的成效，这种技术在微生物多样化研究应用中的还无法达到最佳效果，如DGGE技术能将微生物中的DNA分解，达到有效降解环境中的污染物，起到保护环境的作用。但是，这种技术自身还存在一些缺点，如只能分解较小的片段，一般都是500bp以下的DNA分子，对于相对分子较大的片段就无法达到理想的效果。所以，技术研究人员不能停止研究脚步，还需要进一步针对当前DGGE技术使用中的难点进行研究和分析。最终找到解决方案，进一步提升技术水平，使之能更好的为环境保护作出贡献，并且能被推广应用到其他各个领域中，为构建社会主义和谐社会以及实现社会可持续发展做贡献。尤其是随着信息技术的不断发展，未来DGGE技术在微生物多样性研究中的应用要引进计算机技术的数据储存、管理以及整理分子的功能，科学规范的对微生物中的分子进行分类鉴定，长久储存鉴定数据资源，为以后研究人员提供丰富、大量的数据资源，进一步推进我国生物工程事业的发展。

结束语

综上所述，目前DGGE技术在环境多样化研究中已经得到广泛的使用，主要有废水处理、土壤生物研究以及膜生物处理研究等方面的应用，其在实际应用中已经得到良好的效果，能将微生物中具有相同长度且序列号有差异的DNA分解开来。使用DGGE技术进行环境微生物多样化研究时，一般采用取样分析法，通过直接过着间接取样，对微生物中PCE扩增物进行优化，然后在最佳电泳的条件下，利用聚丙烯酰胺凝胶对DNA进行分解。通过反复试验最终分解微生物中的DNA链，达到降解环境污染物的最佳效果，实现社会的可持续发展。

[1]张珍妮,吴晓芙,陈永华. DGGE技术在环境微生物多样性研究中的应用[J]. 生物技术通报,2010(01)

[2]赵兴青，杨柳燕，陈灿. PCR-DGGE技术用于湖泊沉积物中微生物群落结构多样性研究[J]. 生态学科,2009(11)

[3]路盼盼.基于PCR-DGGE技术的新疆泥火山土壤真菌多样性分析[D]. 石河子大学：生物化学与分子生物学,2011

[4]江云飞,蔡柏岩.PCR-DGGE技术在细菌多样性研究中的条件优化[J].生物技术,2009(05)

[5]刘慧杰,杨彩云,田蕴等. 基于PCR-DGGE技术的红树林区微生物群落结构[J]. 微生物学报,2010(07)

[6]曹小妮. 克拉玛依渗油与采油污染区细菌多样性研究[J]. 石河子大学:生物化学与分子生物学,2009(11)

[7]焦雷.PCR-DGGE法在抚州市西湖水体微生物多样性研究中的探讨[J].内蒙古大学：环境工程,2010(11)

[8]吴进,胡国全,宋金龙. 基于mcrA克隆文库和PCR-DGGE技术对牛粪为原料的农村户用沼气池产甲烷古菌的多样性研究[J].中国沼气,2012(03)

[9]刘晶晶,沈李东,胡宝兰. Biolog和PCR-DGGE技术解析椒江口沉积物微生物多样性[J]. 环境科学学科,2012(06)

[10]吴伟林,张秀霞,单宝来. PCR-DGGE技术用于石油污染土壤中微生物群落结构多样性的初步研究[J]. 石油学报(石油加工),2010(04)