猪链球菌的分离鉴定及药敏试验

陈松林

（江苏省如皋市畜牧兽医站，江苏如皋 226500）

猪链球菌的分离鉴定及药敏试验

陈松林

（江苏省如皋市畜牧兽医站，江苏如皋 226500）

猪链球菌病是由多种不同群的致病性链球菌引起的动物和人类共患的1种细菌性传染病。其特征主要表现：急性病例常为败血症和脑膜炎，慢性病例则为关节炎、心内膜炎及组织化脓性炎等。本病呈世界性分布，发病率和死亡率均较高，给养猪业与人类的健康造成很大的威胁。1998年以来，如皋市部分养殖场（户）出现了来势猛烈、传播快、病程短、死亡率高的败血型链球菌病，造成了重大的经济损失。尤其自2005年6月四川资阳发生猪链球菌2型感染人的事件后，链球菌病的防控再次成为生猪疫病防控的焦点。为了更好地抑制本病，在如皋市大规模流行期间，我们进行了猪链球菌的分离鉴定和药敏试验，提高了本病的治愈率，现将试验过程和步骤报告如下。

1 材料与方法

1.1 病料来源

2006年7月无菌采集如皋市搬经镇某发病猪场的2头疑似链球菌病的病死猪的肺脏、心血、肠系膜淋巴结、肝脏、心包液和病变关节液。

1.2 主要试剂及仪器

鲜血琼脂、普通琼脂、麦康凯琼脂、半固体糖发酵培养基、血清肉汤培养基、匹克氏增菌液按常规方法制备。

1.3 细菌的分离鉴定及结果

1.3.1 细菌的分离 将所采病料分别涂片，革兰氏染色镜检，可见细菌为革兰氏阳性，菌体呈圆形、双球形或短链状，无鞭毛，无芽胞，不运动，无荚膜，无粘液层，无两极着色现象。无菌采取病料于鲜血琼脂平板上划线分离，37℃有氧条件培养24 h，可疑菌落接种于匹克氏增菌液，37℃培养24 h，挑取单个菌落经涂片、染色、镜检，证实为纯培养物，将其接种于鲜血琼脂斜面上进行培养，得到纯培养物。

1.3.2 培养特性试验 分离菌接种于血清肉汤、普通琼脂平板、鲜血琼脂平板，麦康凯琼脂平板等培养基中，37℃有氧条件下培养观察其生长表现。同时，另1组置于厌氧罐中37℃培养观察其生长表现。结果分离菌为兼性厌氧菌，无运动性，在普通营养琼脂平板上生长极贫瘠，培养24 h后仅在划线处见有针尖大小的菌落；血清肉汤中血清肉汤浑浊，不形成菌膜，培养48 h后上清较透明，底部有颗粒状沉淀。在血琼脂平板上生长好，37℃、24 h即能长出灰白色、圆形、透明、闪光、中央隆起、表面光滑露珠状小菌落，菌落周围呈β溶血，在麦康凯琼脂平板上不生长。

1.3.3 生化试验 用分离菌纯培养物进行蔗糖、山梨醇、棉实糖、葡萄糖、甘露醇、蕈糖、乳糖、菊糖、水杨苷、马尿酸钠试验。试验结果详见表1。

表中表明分离细菌的生化反应结果均符合猪链球菌的生化特性，说明分离的菌为猪链球菌。

1.3.4 血清学试验 经对猪链球菌分离菌群送检，进行标准阳性血清玻片凝集试验，结果表明为猪链球菌2型。

根据以上试验结果结合临床症状和病理变化确定病死猪的致死病因为猪链球菌。

2 药敏试验

2.1 实验材料

普通麦糠凯培养基：江苏省卫生防疫站自由选择试剂厂生产。

药敏试纸：杭州微生物试剂有限公司生产和自制。

细菌：本实验室分离鉴定培养的链球菌。

仪器：接种环、酒精灯、打孔器、移液器、滴头等。

2.2 药敏片试验法

（1）在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量链球菌的菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式：用灭菌接种环取适量链球菌分别在平皿边缘相对4点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后，找到第2点划线至平皿的1/2，依次划线，直至链球菌均匀密布于平皿。（另：可挑取待试链球菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检链球菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密，直接悬液法要把菌液浓度用生理盐水或PBS调到0.5个麦氏标准再涂布均匀。）

（2）将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏片贴到平皿培养基表面。为了使药敏片与培养基紧密相贴，可用镊子轻按几下药敏片。为了使能准确的观察结果，要求药敏片能有规律的分布于平皿培养基上；一般可在平皿中央贴1片，外周可等距离贴若干片（外周一般可贴7片），每种药敏片的名称要记住。

（3）将平皿培养基置于37℃温箱中培养24 h后，观察效果。

2.3 结果判定

在涂有链球菌的琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散，其浓度呈梯度递减，因此在纸片周围一定距离内的链球菌生长受到抑制。过夜培养后形成1个抑菌圈，抑菌圈越大，说明该菌对此药敏感性越大，反之越小，若无抑菌圈，则说明该菌对此药具有耐药性。其直径大小与药物浓度、划线细菌浓度有直接关系。

2.3.1 判定标准

药敏试验的结果，应按抑菌圈直径大小作为判定敏感度高低的标准。结果详见表2。

表2 药物敏感试验判定标准

2.3.2 药敏试验结果

根据药敏试验判定标准判定结果如下：极敏：阿莫西林、头孢拉定、头孢曲松；

高敏：青霉素、氨苄西林、卡那霉素、氟苯尼考、环丙沙星；中敏：阿米卡星、庆大霉素；低敏：多西环素、链霉素。

2.4 药敏试验的应用

（1）选择极敏或高敏药物进行治疗，避免盲目用药；（2）根据不同地区和药物使用选择敏感药物；（3）选用几种有效药物交替使用，以降低耐药性的产生。