果酒酵母选育及酵母对香气成分影响的研究进展

刘永衡，华惠敏，吴桂君，张 琪

（银川能源学院 生物与农业工程系，宁夏 永宁 750105）

果酒是以新鲜水果为原料，利用自然发酵或人工添加酵母菌来分解糖分而制造出的具有保健、营养作用的低度饮料酒如葡萄酒、苹果酒、李子酒等。果酒不仅具有水果的天然香味而且富含多种维生素和氨基酸，在提倡健康生活的现代社会深受青睐。新鲜水果由于含水量高、产后呼吸代谢旺盛、极易腐烂，不耐贮存，果实成熟采摘后若不及时处理将造成腐烂，这对果农种植的积极性有不可忽视的负面影响。果酒生产不仅解决了水果不耐贮存的问题，而且提高了产品的附加值。在酿造过程中，不同的果酒酵母以及发酵产生的香气物质对于果酒的风格有着重要的影响。随着果酒酿造业的迅速发展，为了更系统深入的研究果酒的品质，人们对于果酒的研发除了传统的发酵工艺以及感官品质外，对于果酒酵母的选育和香气成分的分析等更深层次的探索研究也越来越受到关注。

1 果酒酵母的选育

菌种的筛选来源主要有2个途径：选种和育种。前者是指从自然样本中通过筛选与分离获得菌株；后者是指在实验室中对已有、保藏的微生物菌株进行遗传改良[1]。近年来，随着果酒市场以及人们消费水平的发展趋势逐年增高，原有的传统自然发酵已经不能满足大规模工业化生产，为提高生产效率，筛选添加酵母发酵的研究应用开始逐渐增多。果酒酿造中使用的酵母包括酿酒酵母和非酿酒酵母，酿酒酵母主要是一些葡萄酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），而非酿酒酵母属的酵母或称为产香酵母，主要有孢汉逊酵母属（Hanseniaspora）、克勒克酵母属（Kloeckera）、假丝酵母属（Candida）、毕赤酵母属（Pichia）等酵母。由于传统酿酒酵母酿造的果酒风味较为平淡，为改善风味，非酿酒酵母的选育逐渐成为近年来新的果酒研究方向。有研究表明，非酿酒酵母会对果酒的总体风味产生积极的影响，能生成更多的芳香物质和特别的风味成分，使果酒的风味特征明显改善[2]。

1.1 果酒酵母的选种技术

果酒酵母的筛选多来自于成熟果实的表皮、自然腐烂发酵的果肉、果汁以及果园的土壤等。目前大多数选种研究集中在优良传统酿酒酵母的自然筛选以及驯化方面，尤其是在欧美一些注重果酒传统品质的国家。如BELL PJL等[3]以野生酿酒菌株（S cerevisiae）为研究对象，在高渗透压下的条件下经过驯化后得到了具有更高的麦芽转化率的菌株。EZERONYE OU[4]以4种热带水果果汁为发酵底物，比较筛选了棕榈酒酵母OW-11以及酿酒酵母CBS 8066和ATCC 4126的培养基利用效率以及生长速率，通过测定酵母生长OD值以及残糖等理化指标，证明棕榈酒酵母OW-11的各方面发酵性能都优于其他两种菌株，有望用于葡萄酒的工业生产。近年来国内在果酒酵母的选种鉴定研究也取得了一定的成绩，果酒研发不再局限于使用传统的葡萄酒酵母，而是筛选新的专用果酒酵母。周帼萍等[5]以木瓜和市售各种带酒味的腐烂水果表面为分离源，分离得到68株酵母菌，经过三级筛选获得3株适合酿造木瓜果酒的酵母菌，编号分别为Y-3-1、Y-4-1和Y-9-1。经感官评定，采用这3株菌所酿制的木瓜果酒明显优于常用的酿酒用耐高温活性安琪酵母。方亮等[6]从黑莓自然发酵物中经过三级分离筛选得到1株适宜黑莓果酒发酵的酵母菌，命名为CNBG001。该菌株酒精耐受能力可达16%vol，耐SO2能力可达200mg/L，是1株优良的黑莓果酒酿造酵母。谢建华等[7]为筛选得到适合发酵杨梅果酒的酵母菌株，从优质自然发酵杨梅汁中分离筛选到一株酵母Y-9，对该酵母菌进行形态学鉴定、生理生化等试验，结果显示，杨梅酒中的酵母菌为郎比可酒香酵母（Brettanomyces lambicus）。目前，果酒酵母菌种的选种技术还存在着一定的局限性，如分离筛选得到的菌种鉴定不够成熟、系统，大部分研究仅仅局限于形态、生理学以及发酵性能的比较鉴定，而对于其生物分类、分子生物学层次的鉴定研究鲜有报道。建议从分子角度更深层次的研究酵母选种，以便于为转基因高性能菌种的研究提供基础。此外，从自然界筛选的野生酵母很难具有理想的特性直接用于发酵工业生产，需要进一步的驯化培养和利用现代的育种技术进行遗传性状改良，使其能达到工业大生产的要求。

1.2 果酒酵母的育种技术

微生物菌种育种技术可分为诱变育种技术、基因重组育种技术以及转基因技术，一株经过遗传改良的菌株可以使其原有生产性状有明显的改善和较大幅度的提高，有利于现代工业化大规模酿酒的高效生产及控制。

1.2.1 诱变育种技术

诱变育种是利用自发突变原理，让微生物接触到诸如紫外线辐射、电离辐射（X射线、γ射线或中子等）和许多能与DNA碱基反应或干扰DNA复制的各类诱变剂（如硫酸二乙酯（diethyl sulfate，DES）、5-溴尿嘧啶（5-bromine uracil，5-BU）、氮芥（nitrogen mustard，NM）、亚硝基胍（nitrosoguanidine，NTG）等），将突变频率增加数倍以上，再配以有效的培养选择，以期获得性状和生产特性显著提高或改善的新菌株。由于这种技术操作比较简单，条件和设备要求都较低，因此得到了广泛的应用。为提高诱变效果，目前诱变育种多采用复合诱变，即用两种以上的诱变剂进行复合处理。如赵祥杰等[8]将筛选到的一株桑椹果酒酵母经紫外辐照和微波处理，最终筛选到的ME44菌株在两周发酵周期内酒精体积分数为11.7%，比出发菌株提高7%以上，而且菌株在起酵时间及果酒品质方面都有提高。此外，将酵母出发菌株进行原生质体制备处理也可以极大地提高突变频率，是目前较普遍的酵母诱变育种方法，如王玲等[9]以1株自行分离的菠萝果酒酵母菌H10为出发菌株，制备原生质体后进行紫外诱变选育优良突变菌株，经筛选后得到1株对菠萝汁发酵能力强、产香能力好、耐乙醇和SO2、遗传稳定性好、适合热带地区菠萝果酒生产的优良酵母菌株H10-15。近年来，随着科技的不断进步，太空育种成为了新的研究焦点，太空育种主要是通过强辐射，微重力和高真空等太空综合环境因素诱发植物种子的基因变异。作为现代微生物育种的技术之一，其具有变化率高、变化幅度大、有益变化多、变化稳定快、变化后遗传性好等优点。近期有新闻报道称燕京酵母菌种搭载“神舟十号”遨游太空，在不久的将来，相信会有更多的酵母菌种包括果酒酵母进行太空育种研究。虽然诱变育种技术有其操作简单、技术要求低等优点，但是其步骤繁琐，从诱变处理到菌种筛选、发酵性能测试都需要大量的工作，整个研究周期长，而且该技术存在着一定的盲目性、工作效率低等缺点，如诱变得到的上百株菌株很有可能都是原有优良性状退化的负突变菌株，对于优良突变菌株的突变性状也存在着未知性。

1.2.2 基因重组育种技术

基因重组育种是基因型不同的个体交配产生不同于亲本基因型的个体，其本质是个体之间遗传信息的重组。酵母菌的基因重组育种主要包括杂交育种和原生质体重组育种，杂交育种是指利用不同接合型的单倍体酵母菌株或子囊孢子进行的重组育种，此技术可以消除菌株在经历长期诱变后所出现的产量性状难以继续提高的障碍，因此是一种重要的育种手段。BELLON JR等[10]利用杂交育种技术将非酿酒酵母（S.kudriavzevii）和酿酒酵母（S.cerevisiae）进行了杂交，结果表明以杂交后的新菌株（AWRI 1503）酿造的酒比以亲本酿造的酒在香气及风味口感上的表现均较好，目前已应用于商业化的葡萄酒生产。原生质体融合技术是将两亲株先经酶法破壁制备原生质体，然后用物理、化学或生物学方法，促进两亲株原生质体融合，经染色体交换、重组而达到杂交目的，通过筛选获得集两亲株优良性状于一体的稳定融合子。与传统杂交育种相比，该技术大大缩短了育种的时间，并且重组后的菌株更加稳定。如张琇等[11]从灵武长枣果皮上筛选分离出一株性能优良的酿酒酵母（YLLJ），将其制备成原生质体与红酵母原生质体在促融合剂聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）作用下进行融合，最终得到的融合子既有酿酒能力又能产类胡萝卜素。INFANTE MAJOLLI MV等[12]以酿酒酵母和文氏曲霉（Aspergillus wentii）为亲本株进行原生质体融合研究，通过发酵实验筛选出了3株能够产生优雅果香的融合子。基因重组技术在果酒酵母的选育方面研究仍然较少，这也许跟该技术难以消除种属间的遗传隔阂有关，即远缘杂交不亲和，比如不同种属间微生物的优良性状很难通过重组而获得新遗传型的菌株。国内尚未见到酵母菌株与其他属菌株的重组育种研究（如酵母和霉菌），有关此方面的研究技术空白希望能够得到填补。

1.2.3 转基因技术

转基因技术是将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，经过导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，又称基因工程，其与基因重组育种技术最大的区别在于基因重组育种的重组方式是体内重组，转基因技术是体外重组，可以定向的对生物体进行遗传改良。目前国内对于果酒酵母转基因育种的研究鲜有报道，大部分研究工作来源于国外，这可能也是因为国内技术条件以及果酒酵母转基因研发支持力度的限制。BORNEMAN AR等[13]在酵母菌株AWRI796发现了一个新的编码合成芳基醇脱氢酶（aryl-alcohol dehydrogenase，AAD）的基因，将此基因导入到其他酵母发现在发酵期间乙醇产率以及香气成分都有所提高。DUFOUR M等[14]对多株酿酒酵母进行转基因遗传修饰改良，将β-lyaseIrc7p基因转移到了这些酵母菌株后，发现新的菌株可以产生更多的半胱氨酸共轭型挥发性硫醇，可以改善酒的香气风味。葛向阳等[15]将编码海藻糖合酶复杂的调节亚基基因TSL1在酿酒酵母Z-06中过度表达，最终发现酵母菌对高温的抗逆性以及葡萄糖消耗率都有所提高。相比于以上几种育种技术，转基因技术除过研究成本较高外，其目标性强、消除了遗传隔阂等优点都是其他几种技术无法比拟的。目前国内外对于优良果酒酵母菌株基因组的分析与应用研究依然很少，对于能够提升果酒品质的菌株基因分析及转基因技术应用有待于进一步加强。近年来，随着生物技术的迅速发展，酵母菌的基因组结构及功能也在逐步揭示，该技术有望大规模应用于果酒酿造工业。

2 酵母对果酒香气成分的影响

香气成分是影响果酒风味质量的重要因素，果酒香气主要有2部分组成：果实的原生香以及酿造后产生的发酵香。原生香是果实在生长成熟的过程中自身产生的一些挥发性物质；发酵香是在发酵过程中产生的香气成分，发酵时，酵母将糖转化为酒精，同时产生出多种原生香中不存在的香味物质，主要包括酯类、高级醇类、有机酸、酮类等，少数酵母通过代谢能够产生一些在植物花朵含量较高的香气成分，如单萜[16]。但大量研究表明，酯类和高级醇类是果酒香气中含量最多的成分，如3-甲基丁醇、正戊醇、苯乙醇、丁二酸乙酯等[17-21]。果酒香气成分的研究方法主要是一些提取分离手段结合气质（GC-MS）联用技术，国内外学者在此方面的研究较多，BUTKHUP L等[22]利用固相微萃取联合GC-MS技术分析了桑葚酒的香气成分，共发现80种挥发性成分，主要包括高级醇类、脂肪酸、醚类、挥发性酚类物质。REDDY LVA等[23]以芒果为原料发酵酿酒，通过GC-MS跟踪分析，发现了32种挥发性成分，其中部分成分在新鲜芒果中不存在，除过乙醇、正丙醇、异丁醇、乙酸乙酯等主要醇类、酯类成分，还生成了少量的丁酸苯乙酯、环己烷类的成分。此外，分析方法越先进，仪器越精密，同样的果酒发现的香气成分越多，如JANACOVA A等[24]利用气相色谱-嗅觉测量法（gas chromatography-olfactomety，GCO）联合GC-MS技术从一种酒中发现了227种化合物。

2.1 酵母发酵过程对香气成分的影响

酵母发酵过程对果酒香气成分有着重要的影响，尤其表现在酿造前后以及时间长短方面。DUNLEVY JD等[25]研究发现葡萄浆果与发酵后葡萄酒的香气成分差异很大，尤其表现在单萜类成分和2-甲氧基吡嗪类成分的变化，此外研究表明葡萄浆果的原生香气成分对葡萄酒品质影响并无直接关系。这说明随着发酵的时间变化，酵母菌在果酒发酵过程中产生的代谢产物也在发生着不断的变化。而且果酒的香气主要是在酵母发酵过程中产生，与原料本身的挥发性香气成分联系较小。如陈娟等[26]从大十桑椹汁、蜂蜜桑椹发酵原酒和陈酿酒中分别检测出挥发性成分51种、64种和68种。通过成分对比发现桑椹汁香气成分主要以棕榈酸和亚油酸2种高级脂肪酸为主，发酵原酒和陈酿酒则以低级脂肪醇、酯、酸和酮以及芳香醇等为主要香气成分，而且通过比较发现大十桑椹果汁经发酵和陈酿过程后，香气成分的数量和相对含量变化很大。从这些研究可以看出酵母对于香气成分的影响较大，对果酒品质有重要的作用。

2.2 不同酵母菌对果酒香气成分的影响

同一酵母属的各种酿酒酵母所产挥发性物质有较大的差别，不同属间酵母所产的挥发性物质有更大的差异，比如有的酵母酒精产率高，而有的酵母其发酵产品的残糖和乙酸乙酯的含量较高。在果酒的发酵过程中，酵母种类对高级醇的形成影响较大，一些研究证明非酿酒酵母比酿酒酵母能产更多的高级醇，国外学者在这方面的研究起步很早，如POLLARD A等[27]比较了从苹果汁中分离的各种酵母和人工酵母所产高级醇、苯乙醇浓度，并与自然发酵的天然酵母进行了对比，发现非酿酒酵母属酵母产高级醇能力差别很大，球拟酵母（Torulopsis datilla）所产高级醇浓度最低，柠檬形克勒克酵母（Klorekera apiculata）所产高级醇浓度最高。此外，天然酵母产香丰富，人工酿酒酵母产香较淡且纯净。WUCHERPEFENNIG K等[28]分别研究了野生酵母（Apiculauts yeast）和人工培养的酵母（Geisenheim Nr.49）生产的苹果洒的风味，发现野生酵母能产生更多的挥发物质，形成风格典型的苹果酒，人工培养的酵母产香弱，能生产香气淡雅的苹果酒。能产更多醇类的酵母也能产更多的酯类成分，这种情况在厌气条件下更为明显。国内此方面的研究起步较晚且鲜有报道，李锐等[29]研究不同来源酿酒酵母对柑橘果酒香气成分的影响，以锦橙表皮和柑橘园土壤为酵母的来源，筛选得到3株酵母菌L3、L5、L9，通过测定多项理化指标结果显示3株酵母所酿柑橘果酒的香气成分有特异性差异，庚酸乙酯、萜品油烯等13种物质为L3酵母菌所酿柑橘果酒独有；月桂醇、乙酸异丁酯等8种物质仅见于L5酵母菌所酿柑橘果酒中；正辛醇、5-甲基呋喃醛等4种物质只在L9酵母菌所酿柑橘果酒中存在。柳素洁等[30]采用5种酿酒酵母：W15、EC1118、S7、L45、71B进行香蕉浆发酵，发现不同酵母酿造的香蕉果酒在总酸、总酯、香气成分等方面都有所差异，也因此筛选出了最佳的香蕉蒸馏酒生产用酵母为EC1118，其酿造的果酒具有乙酸乙酯为主体的清雅、谐调的香气和辛酸乙酯的典型香蕉味。研究酵母菌和果酒香气之间的联系对于果酒酵母的筛选和提高果酒的品质都有重要的参考意义，目前国内外在酵母菌与香气成分联系方面的研究存在缺乏系统性以及研究深度不够等问题，例如在酵母产香气成分的代谢途径机制阐明方面的研究仍然处于空白地位，这些问题都有待于进一步解决。

3 展望

我国水果年产量约8000多万t，位居世界首位，但我国水果深加工能力较国外依然很落后。随着人民生活水平的提高以及果酒生产者加工技术不断发展，近年来我国果酒业结束了长期徘徊不前的局面，发展呈现出良好的态势，市面上果酒的品种也越来越多。在果酒的生产工艺以及设备研究日趋成熟的同时，对于果酒的品质研究也应该重视，因此选育优良专用的果酒酵母代替葡萄酒用酵母，加深对果酒的主要香气成分及其形成机理进行研究以便于控制好影响果酒香气形成的因素，这些研究都可以使果酒特征更加突出，品质更加优良，对于促进果酒酿造工业的发展很有必要。

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