猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2研究进展

闫军霞，毕孝瑞

（1．汕尾出入境检验检疫局，广东 汕尾516600；2．鲅鱼圈出入境检验检疫局，辽宁 营口115007）

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是目前世界上对养猪业带来重大经济损失的一种传染性疾病，PRRSV是该病病原，一种具有包膜的单股正链RNA病毒，ORF1a，ORF1b编码该病毒非结构蛋白（Nsps）其编码的ORF1a，ORF1ab两个具有病毒的复制酶和RNA聚合酶功能的多聚蛋白pp1a和pp1b在蛋白水解酶裂解作用下产生至少12个推测的非结构蛋白Nsp1～Nsp12［1］。Nsp2作为PRRSV最大的非结构蛋白，具有高变异特性及多种生物学特性且应用广泛，在病毒研究中，Nsp2一直是研究热点，本文就PRRSV的非结构蛋白Nsp2分子生物学特性、免疫学功能及其应用做一简要综述。

1 非结构蛋白Nsp2的生物学特性

在所有的非结构蛋白中，Nsp2是PRRSV中最大的复制相关蛋白，目前已鉴定Nsp2四个主要功能区：N－端的半胱氨酸蛋白酶结构域（PL2）；功能尚未清楚的中间高变区；近C端的高亲水性转膜区；功能尚不明确的C端富含半胱氨酸残基保守区。PRRSV非结构蛋白Nsp2半胱氨酸蛋白酶结构域（Cp），介导 Nsp2／Nsp3切割，还是 Nsp4丝氨酸蛋白酶的辅助因子，C端与Nsp3之间的非共价结合作为多蛋白病毒复制复合体装配的膜锚定器支持双膜囊泡（DMV）的形成，Nsp2通过PL2区介导自身从前体蛋白上解离［2－3］，相关研究表明，Nsp2在感染过程中存在多种不同的亚型，包括nsp2a～nsp2f，nsp2a与nsp2产物的识别相关，一些小亚型（如nsp2d～nsp2f）对病毒的复制并无影响［4］。Nsp2是一个多功能蛋白，不同结构域功能特性主要表现在对病毒的复制、致病性以及对宿主免疫调节方面作用。

1．1 对病毒复制及致病性方面 Nsp2半胱氨酸蛋白酶结构域属于哺乳动物肿瘤坏死因子相关蛋白超级家族成员，该蛋白酶活性对病毒的活力恢复起关键作用。在PRRSV感染的细胞中，Nsp2定位在核周区，该区域与上述双膜囊泡（DMV）形成密切相关，是病毒的复制和转录的关键部位［2］。王凤雪等发现，在 Marc－145细胞上感染PRRSV 病毒时Nsp2蛋白对PRRSV复制早期有正向调控作用［5］。2006年暴发的高热病，鉴定病原为PRRSV变异株，在Nsp2上表现为30个氨基酸的不连续缺失，该病毒的毒力增强似乎与Nsp2 30个氨基酸缺失有关，但最终研究发现，该缺失与病毒高致病性没有必然的联系［3］。在体外传代过程PRRSV Nsp2也常出现新的自然缺失，对病毒的复制影响，但对病毒致病性无直接联系。然而，有研究表明，在体外传代过程中病毒出现致弱，在Nsp2出现相关的突变可能与病毒毒力致弱有关，Leng等［6］对TJ株进行连续传代过程中，出现58个氨基酸的突变，同时在非结构蛋白Nsp2区域在不连续的30个氨基酸缺失位481位和533－561位之后又出现连续120个氨基酸的缺失，传至第20代时病毒致病性明显减弱，推测TJ株在这一传代过程中非结构蛋白和结构蛋白所发生的遗传变异对病毒毒力致弱起到一定作用。

1．2 对宿主机体免疫调节作用 Nsp2蛋白被认为是PRRSV中最具有免疫原性的蛋白之一，可以诱导机体较强的抗体应答反应。Yan等鉴定出BJ－4株六处B细胞抗原表位，其中4个被确定为新型线性 Nsp2 表 位：T（73）－T（86），D（385）－D（394），P（452）－S（466）和P（467）－S（477）［7］。所有6个特异性抗体都能中和PRRSV表位，表现出免疫原性。变异株PRRSV Nsp2 30个氨基酸的缺失部位包含有之前已鉴定的B细胞表位和潜在的T细胞表位。Nsp2的高突变性以及自然缺失等都可能与病毒逃避宿主免疫监测相关。有相关研究对Nsp2六处抗原表位（ES2－ES7）进行缺失，发现缺失ES3，ES4，ES7时能拯救出病毒，缺失ES4，ES7时病毒出现致弱，然而缺失ES3时却相对亲本株出现最高病毒滴度峰值，且IL－1β，TNF－α表达水平同时出现下调，表明Nsp2上的显性表位不是病毒复制所必须，但是在宿主免疫反应中起重要作用［2］。Faaberg构建了 PRRSV VR2332Nsp2 四 处 缺 失 （r727－r813，r543－r726，r324－r523，r324－r726），结果发现感染缺失727－813位的毒株能明显降低淋巴结肿大程度，感染其中3个缺失株机体产生γ干扰素水平显著降低，表明该缺失部位可能改变了机体产生干扰素以及其他细胞因子的产生［8］。相关研究已证明，Nsp2通过影响多条通路来达到免疫调节效果：包括半胱氨酸蛋白酶结构域通过抑制IFN调节因子IRF－3的激活从而影响IFN的产生，另外通过干扰NF－kB信号通路中抑制因子IKBa的聚泛素化过程从而影响IKBa的磷酸化使得抑制因子不能降解最终导致I型干扰素的表达的抑制［9］。同时，Nsp2通过影响干扰素刺激基因15（ISG15）的产生和结合而达到抑制ISG15的抗病毒作用。然而Nsp2具有多重调节效果，Nsp2还具有激活NF－kB的作用，同时诱导NF－kappaB－依赖炎性因子的表达［10］。上述研究表明，Nsp2在调节宿主炎症反应中具有多功能调节作用。具体相互之间的调节机理还有待进一步研究。

2 非结构蛋白Nsp2特性的应用

Nsp2具有高度的变异性以及在不同株之间表现为显著的差异性，同时是欧洲型和美洲型关键分化变异位点。其中间高变区存在自然突变，插入，缺失现象而转膜区和PL2区却高度保守，这些特性使得Nsp2成为理想的检测基因变异的标志性靶位点，常用于流行病学的监测，广泛应用于诊断检测方法的建立及标记性重组疫苗的制备等［3］。

2．1 分子流行病学调查 毒株的 ORF5基因与Nsp2基因在自然环境及免疫压力作用下发生了较大变异，因此常对Nsp2和GP5进行基因序列分析来了解PRRSV流行毒株的遗传变异情况和分子流行病学情况。近几年来国内各地区分离株自2006年后主要以Nsp2 30个氨基酸不连续缺失株为主，且同源性均与高致病性毒株达90%以上。经典毒株分离率明显低于高致病性毒株，且相关报道表明，分离到非缺失株与国内外分离的非缺失株相比，已经存在一定程度的变异，在进化树上显示的亲缘关系也渐行渐远［11］。同时缺失株之间又存在一些新的变异特点，黄元等在广东省地区分离到一个新型的PRRSV毒株BL2，其Nsp2基因540位～563位发生24个氨基酸序列的缺失，该缺失位于高致病性毒株的缺失区域内，与我国2005年分离的经典毒株SHB（91．5%）同源性最高，同时与2006年后流行的高致病性毒株也有较高的同源性（89．9%～91．3%）且为高致病性毒株［12］。Zhou等在中国分离到两株新型变异株在Nsp2除原来的缺失外，又分别出现额外的36nt和57nt的缺失，且分别与JXA1同源性达到98．9% 和 97．1%［13］。Li B，等证明，高致病性毒株的新的基因变异特性并没有显著改变其致病性［14］。

2．2 诊断方法建立及疫苗研制 Nsp2本身具有多个抗原表位，有较高的免疫原性，同时常规PRRSV检测中，我们常需要区分野毒和疫苗毒感染及经典株和缺失株的感染，由于Nsp2的中间高变区具有耐受突变，插入，缺失能力，因此常作为靶位点进行基因改造广泛应用于各种诊断方法研究。林华等［15］以高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HPPRRSV）重组Nsp2蛋白为包被抗原，建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法，该方法敏感性高、特异性强，可用于猪繁殖与呼吸综合征的常规诊断及流行病学调查。在区分疫苗毒和野毒感染方面，相关实验室利用Nsp2可突变区插入GFP（绿色荧光蛋白）作为阳性标签，并建立相应的ELISA检测方法，利用该标记疫苗及相应抗原包被的ELISA试剂盒可以用于区别野毒感染和疫苗毒感染；对于缺失株和经典株感染的区分，郭焕成等根据高致病性PRRSV Nsp2美洲型缺失及经典毒株核苷酸差异，建立寡核苷酸芯片方法，能够准确鉴别高致病性PRRSV Nsp2缺失变异株［16］。在疫苗研制方面，针对Nsp2常用于制备基因缺失苗以及基因标记工程苗，Kim等通过在Nsp2非关键区进行缺失并插入肽标记，发现拯救毒株毒力显著降低，并能被特异抗原包被的ELISA试剂盒检测，再次验证了Nsp2是用来发展标记疫苗和弱毒苗的潜在靶基因［17］，Xu等在对疫苗毒HuN4－F112Nsp2复制非关键区缺失25个氨基酸，并插入新城疫N蛋白免疫显性B细胞表位（49个氨基酸）作为一种基因标记疫苗，在动物体内能同时产生对抗NDV NP及PRRSV的特异性抗体，而且缺乏针对缺失的25个氨基酸的抗体，免疫猪获得很好的免疫保护，该疫苗可以作为一种有效的对抗PRRSV的基因标记苗［18］。

3 总结

PRRSV Nsp2多区域蛋白，其较高的免疫原性，高突变性，多调节功能以及耐受突变，缺失及插入的能力，使得对Nsp2的研究能在很大程度上对PRRSV流行病学情况、致病机理方面以及诊断方法和疫苗制备方面提供了很广泛的视野，同时对PRRSV Nsp2相关生物学特性的了解有助于我们今后对Nsp2的进一步研究提供一定的基础。

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