间充质干细胞的特性及临床应用前景

张 平 张本恕(河北大学附属医院神经内科，河北 保定 07000)

2007年英国科学家 Chamberlain等〔1〕在Stem Cell杂志上撰文指出:成体干细胞对人体自我修复和组织再生至关重要，成体干细胞的减少是人体衰老的主要原因。这一发现对于人类理解衰老过程以及干细胞移植具有重要的意义，这也是近年干细胞和再生医学研究蓬勃发展的原因。目前，科学家致力于发现和制造一种无伦理学限制、无免疫排斥、对供受者无损害、取材方便、纯度高而又保持生物特性的干细胞，以满足基础研究和临床应用的需要。间充质干细胞(MSCs)是成体干细胞家族的重要成员，最近医学领域乃至整个生命科学领域的研究重点和前沿。

1 MSCs概述

MSCs源于发育早期的中胚层和外胚层，具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，属于非终末分化细胞，它既有间质细胞，又有内皮细胞及上皮细胞的特征。1976年Friedenstein和他的同事〔2〕证实了骨髓MSCs的存在，起初认为此种细胞仅存在于骨髓，然而近几年发现，MSCs还可来源于其他组织〔3～6〕，如脂肪组织、胎儿组织、羊水、骨膜。研究证实人体各个器官和组织都存在 MSCs〔7，8〕，并且从不同的动物猫、狗、狒狒、猪均可获得。MSCs的数量随着年龄增长〔9〕和身体虚弱〔10〕下降，新生儿的 MSCs的量最多，然后到80岁时大约下降50%〔9〕。

临床上获得MSCs的方法最通常是从骨髓中分离，常用的骨髓MSCs分离与培养方法有贴壁培养筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪或免疫磁珠分选法。贴壁筛选法是根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，如造血系细胞、内皮细胞等，达到分离纯化干细胞的目的，此方法操作简单，对细胞损伤小。密度梯度离心法是根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。虽然密度梯度离心法理论上可以在原代获得较纯化的细胞，但MSCs公认的密度尚未明确，离心过程中不可避免地造成细胞损失，且离心后仍需用贴壁法进一步纯化，其优势并不明显。近年人们又根据骨髓MSCs表达的某些细胞表面抗原进行收集〔11，12〕，或根据其表面不表达的抗原进行负选〔13～15〕，采用流式细胞筛选法和免疫磁珠法来分选细胞。这两种方法因骨髓MSCs缺乏特异性的表面标志，成本高、技术难度大，所需骨髓量大，并且对细胞的活性影响较大而未广泛应用。因此目前常用方法仍为贴壁法和密度梯度离心法。

2 MSCs的生物学特性

2.1 MSCs的形状和超微结构 原代培养的骨髓MSCs形态多样，主要可分为三种形态:①细胞呈纺锤形或梭形，数量较少;②细胞呈扁平状，多角形，立体感不强，数量比较多;③细胞呈轻度的立方形，数量少，此类细胞增殖速度快，多向分化能力强〔16〕。传代后的骨髓 MSCs形态不同实验室报道有所不同〔17，18〕。人骨髓MSCs在透射电镜下表现为两种不同的形态结构类型:①相对静息期的细胞:核较大，椭圆形，仅含1个核仁，核质比较大，胞质内细胞器少;②处于相对活跃期的细胞:细胞体积大于前者，核呈不规则形，有核袋及核突，含2～3个核仁，核质比较小，胞质中有丰富的细胞器，如核糖体、线粒体、粗面内质网、高尔基复合体等，提示该细胞具有较强的蛋白质合成能力，是其能够分泌许多生长因子维持自身生长分化、支持造血干细胞造血的结构基础。在相邻细胞间可见到一些细胞膜局部电子密度增高、细胞膜内颗粒相互融合的缝隙连接，缝隙连接可加强相邻细胞的连接，且是细胞的一种通讯结构，有利于细胞间信息传递，与细胞分泌、增殖、分化相关。骨髓MSCs间缝隙连接揭示骨髓MSCs有分泌生长调节因子的能力，增殖能力强，分化程度低。扫描电镜下MSCs呈长梭形、鱼群状排列，表面有许多微绒毛〔19〕，说明细胞功能活跃，分泌能力强，可摄取大量营养物质以供较强生长增殖所需。

2.2 MSCs具有多向分化特性 近年来发现这种细胞在特定条件下可分化为多种组织谱系的细胞，包括脂肪细胞、成肌纤维细胞、成骨细胞、内皮细胞、软骨细胞、心肌细胞、肝细胞、骨骼肌细胞、肾小管细胞、神经细胞等。目前相当多的实验已证实，在适当的条件下，MSCs可以分化为脂肪、成骨、软骨、骨骼肌、心肌、肌腱等中胚层来源的细胞，而且还可以横向分化〔20〕为外胚层，如神经细胞〔21〕及内胚层细胞，如肝细胞和胰岛细胞〔22，23〕。另外MSCs的多向分化潜能具有高度的进化保守性，人、狒狒、犬、兔、大鼠和小鼠，甚至禽类的骨髓MSCs均有相似的特点〔24〕。

2.3 MSCs具有“归巢” MSCs有归巢现象，尤其组织有损伤或在病理条件下。在体内，植入的MSCs可以在体内损伤组织微环境的作用下，迁移定位并分化为相应的组织细胞。Jiang等〔24〕将预先标记的骨髓MSCs经静脉植入急性心肌缺血模型的大鼠体内，术后在心肌缺血组织中发现了骨髓MSCs分化的心肌细胞，说明植入的骨髓MSCs归巢(homing)至受损部位并分化为心肌细胞。类似的结果还可以在肌肉损伤〔25〕、脑损伤等很多模型中见到。体内外实验均证实MSCs具有从血中穿过上皮细胞，到达组织中〔26～29〕的能力，体外实验〔30〕内皮细胞和MSCs在共培养时，MSCs与内皮细胞组织接触30 min后形态即发生变化，2 h后变扁与内皮细胞层整合在一起，这些结果表明，纵然在体外MSCs也可以有效的细胞和细胞接触，且开始迁徙穿过内皮细胞;体内试验〔30〕，MSCs通过主动脉套管注入大鼠，2 h后发现心脏血管的内皮细胞的紧密连接小时，MSCs可以和内皮细胞相互作用，30 min后在电子显微镜下发现大约30%的细胞穿过内皮细胞，60 min后大约50%细胞穿过，此后随着时间的延长穿过的细胞数逐渐增多。

MSCs自血中穿过上皮细胞，到达受损的组织，具体机制尚不清楚，但是有可能是受损的组织表达特定的受体或配体促进MSCs的迁徙、黏附和侵润到损伤的组织，就如同白细胞向炎性组织迁移。趋化因子受体和趋化因子配体是白细胞迁徙的必要物质，最近在MSCs表面也发现了这些分子。趋化细胞因子是一个小分子糖蛋白超家族成员，和很多生物过程有关系，包括白细胞运输、血细胞生成、血管发生和器官形成。研究认为43%-70% 的人骨髓MSCs表面表达功能性趋化因子CCR1，CCR7，CCR9，CXCR4，CXCR5 和 CXCR6〔31〕。而另一组通过反转录PCR和免疫组化的实验认为表达的是 CCR2，CCR8，CXCR1，CXCR2，and CXCR3〔32〕。Ponte 和他的同事〔33〕研究证实hMSCs表达 CCR2，CCR3，CCR4，and CXCR4，而且 TNF-α 可以增加CCR2，CCR3，and CCR4表达而不是CXCR4。因此，MSCs表达多种趋化因子受体，尽管报道不一样，但正好反映了MSCs的多样性，这也是MSCs的一个特点。事实上，正因为MSCs表面表达多种趋化因子受体，MSCs才可以向不同组织迁徙，起到修复受损组织或缓解炎症反应的作用。如表达CCR9的MSCs可以迁徙到小肠，或表达CCR1的MSCs可以迁徙到有炎症的关节或有病变的脑组织。

研究证实MSCs表面表达整合素，选择素，趋化因子受体促使MSCs自血液中滚动、黏附、移行穿过血管壁到达组织而发挥生物学作用，与白细胞穿过血管壁的过程相似，但是二者也有区别点。如多项试验证实〔34～38〕，MSCs细胞表面有 P-选择素表达，而L-选择素和E-选择素表达水平低或是不表达，故认为在最初MSCs在血管壁滚动阶段P-选择素起重要作用。研究MSCs表面趋化因子受体和黏附分子的作用，以更好实现体外培养MSCs向损伤组织移行，这将使MSCs支持组织再生，修正遗传缺陷，减缓慢性炎症反应，以及用这些细胞作为生物制剂或基因良好载体成为可能。

2.4 MSCs的免疫调节作用 MSCs属于未成熟的成体干细胞，自身免疫原性低，同种异体移植后无排斥反应或反应较弱〔39〕，在外周耐受，移植耐受，自身免疫，肿瘤逃逸以及母-胎儿耐受过程中是重要的免疫调节剂〔40，41〕。具体的机制可能与母体能够耐受类似胎儿的异体移植物的机制相似，MSCs不表达与人类白细胞抗原(HLA)识别相关的协同刺激分子B7-1(CD80)、B7-2(CD86)以及主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ类分子的HLA-DR产物等。MSCs能够抑制T细胞和NK细胞行使功能，当MSCs与应答T细胞共同培养时非但不会引起T细胞聚集，反而会抑制T细胞增殖，研究证实T淋巴细胞的增殖被阻止在G1阶段，认为是由于MSCs的干预使得细胞周期蛋白D下调所致〔42〕。而T细胞失去应答并不是发生凋亡，是可逆的。如果撤除MSCs的干预，给予合适的刺激，T淋巴细胞可以重新增殖〔43〕;另外 Corcione等〔44〕的实验证实 MSCs能显著减少B淋巴细胞IgM、IgG、IgA的分泌;不仅是未分化的MSCs，已分化的MSCs也不会引起淋巴细胞免疫应答，如Le Blanc等〔45〕实验证实未分化的人胎儿MSCs表达HLAⅠ类分子，不表达HLAⅡ类分子，在诱导MSCs分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞后，HLAⅠ类分子表达增加，但在细胞表面仍检测不到Ⅱ类分子的表达。当将诱导后的细胞作为刺激物，与异体的T淋巴细胞混合培养，仍未引起淋巴细胞的排斥反应。研究表明:可溶性因子和细胞接触介导的机制参与此过程，在使用一些起拮抗作用单克隆抗体阻断转化生长因子β(TGF-β)和肝细胞生长因子(HGF)的实验中表明这些因子起码部分参与了MSCs免疫调节过程〔46〕。尽管MSCs免疫逃逸和免疫调节的机制不完全清楚，但无疑使同种异体MSCs的移植应用成为可能〔47〕。

最近有学者利用MSCs的免疫调节治疗自身免疫性疾病的患者，收到很好的临床效果〔48〕。另外我们注意到MSCs的免疫抑制作用在治疗剧烈移植物抗宿主病(GVHD)时是非常重要的，但对于肿瘤的治疗，由于移植的MSCs的免疫抑制作用可能会导致对肿瘤细胞免疫反应的下降，限制MSCs在肿瘤治疗中的应用。

3 MSCs在临床应用的现状和前景

3.1 MSCs细胞治疗 MSCs的可塑性和自我更新能力为临床上组织再生治疗提供了巨大的潜能。原因:①MSCs在一些特殊的组织可以替代特异性的干细胞，模拟正常细胞的生长并建立新的组织。②MSCs及其衍生细胞在特殊的微环境下分化成为特殊类型的细胞，这些分化后的细胞不仅仅是间充质组织，还有可能是内胚层和/或外胚层的组织。③MSCs在特殊时期特殊场所可以帮助组织再生，也就组织特异性的细胞与MSCs形成异核体;④移植的MSCs可以通过产生一些旁分泌因子如生长因子，细胞因子，趋化因子〔49〕来促进组织特异性的细胞增殖，或者至少是阻止组织进一步被破坏并帮助它修复。

MSCs在治疗先天性骨形成不良和变性关节炎等方面有一定效果。骨形成不良是一种遗传性疾病，主要原因是不能形成Ⅰ型胶原，导致骨矿减少，临床表现为多发性骨折、严重的骨畸形和身材矮小。给3例患者移植异体MSCs 3个月后，可见1.5%～2.0%的供体细胞，骨矿含量增加，生长加速，骨折减少，提示 MSCs移植可以治疗部分遗传性疾病〔50〕。2009年Dharmasaroja指出〔51〕MSCs移植治疗脑缺血动物模型，在体内可以分化为神经元、神经胶质细胞、诱发神经再生和血管再生、激发内源性神经恢复过程，从而获得满意的实验结果。

3.2 MSCs的基因治疗 基因工程细胞:即在体外对供体细胞用基因重组技术导入或删除某一或某些基因以改变细胞的表型(包括生长特性，对毒物的抵抗能力以及生产分泌某些治疗性蛋白)等，即进行遗传修饰过的细胞。

近年来，利用基因工程细胞进行替代治疗和基因治疗已成为医学领域乃至整个生命科学领域中的研究热点和前沿课题，寻找合适的载体和供体细胞是基因治疗中最为困难的技术。目前所用的大部分载体细胞都存在问题，如基因操作困难，所携带基因不能长期高效表达，移植排斥反应难以避免等。因而限制了其在临床中的应用。为提高基因治疗的效率，多年来人们不断寻求理想的载体。现所用的有病毒载体及体细胞载体。用于转基因的体细胞要求取材方便，含量丰富，容易培养，寿命较长。因此人们把目光投向了干细胞。干细胞有多种，最早研究的是造血干细胞，近年来，又有几类干细胞加入这一行列，诸如胚胎干细胞(ESCs)，神经干细胞(NSCs)，MSCs等，各具特色。MSCs作为基因治疗的载体细胞与其他组织干细胞相比具有许多优势:①来源充足，取材较易;②不象ESCs的来源受到伦理道德的制约;③MSCs的分离培养操作简单，体外培养容易大量扩增;④MSCs的移植排斥反应弱。因此MSCs是很好的基因载体。

MSCs基因治疗的研究在各个专业广泛开展且已有用于临床者。最先开始于骨科，Chamberlain等〔52〕则利用基因修饰MSCs来治疗成骨不全，修饰后的MSCs比未经修饰的对照组成骨质量明显提高。MSCs还可以在变性关节炎患者关节中形成新的关节面，从而加速关节的恢复〔53〕。在血液学方面，学者将凝血因子Ⅶ或Ⅸ通过腺病毒转染骨髓MSCs，从而达到治疗血友病的目的〔54〕。因而基因工程MSCs或许是治疗血友病或其他因循环中蛋白缺陷所致的基因病的有效载体。在肿瘤学方面，MSCs用作β-干扰素的载体导入体内肿瘤组织可抑制恶性肿瘤细胞的生长〔55〕。在用于神经系统疾病的治疗方面，对于神经变性疾病的研究已较为肯定，Schwarz等人〔56〕则利用可以表达L-DOPA的基因工程MSCs为供体细胞移植治疗帕金森病，在动物模型中取得了较明显的效果。另外，MSCs在用于治疗脑缺血及脑出血疾病动物模型方面的研究也在多方面展开，MSCs对动物模型脑损伤后功能的恢复非常显著〔57，58〕。有学者〔59〕用腺病毒介导Bcl-2基因修饰MSCs，体外实验证实Bcl-2基因表达并且可以降低MSCs死亡率32%，在低氧状态下增加血管内皮生长因子表达量超过60%;通过心室内注射Bcl-2基因修饰MSCs于左前降支结扎后的急性心肌梗死动物模型，梗死区的血管密度增加15%比单纯移植空载体修饰MSCs的动物模型组，梗死面积减小17%，心脏功能明显恢复，因此移植抗凋亡基因修饰MSCs是治疗急性心肌梗死的一项积极有效的方法。肿瘤坏死因子诱导的配体(stTRAIL)能选择性诱导肿瘤细胞凋亡凋亡而对正常组织和细胞无毒性，有研究〔60〕腺病毒介导肿瘤坏死因子诱导的配体基因修饰脐带血MSCs治疗颅内胶质瘤，发现明显抑制肿瘤的生长，延长带瘤鼠的生存期，证明脐带血MSCs可以作为有效的治疗基因的载体来治疗颅内胶质瘤。

4 展望

到目前为止，大量临床结果证实体内应用MSCs是安全的、可行的，MSCs在再生医学和基因治疗方面具有巨大潜能，充分了解MSCs生物学特性为临床各种疾病甚至一些目前不可治疗的疾病提供新的更先进的更有效的治疗带来了希望，展示美好的前景。

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