不容忽视的潜在的人畜共患病－猪戊型肝炎

王 衡，宁章勇，梁焕斌，古洪浪，张桂红

（华南农业大学兽医学院，广东 广州510642）

2003年，有报道称日本发现两例戊型肝炎（Hepatitis E，HE）感染病例，1例53岁患者尽管早期出现严重的肝炎症状，但很快恢复健康；另1例70岁患者出现同样的初期肝炎症状，但随后出现肝昏迷并死亡于突发性肝衰竭。病原分离得知两例患者感染的为Ⅳ型肝炎病毒；流行病学调查表明，在3个月内2人共同食用5次未熟的野猪肝［1］。另外，香港明报新闻网 （http：／／www．chinanews．com／ga／2010／12－30／2758109．shtml）在2010 年年末报道了这样一则新闻，称香港食物安全中心表示，香港的戊型肝炎由1998年起逐渐上升，至2010年已达100宗，数字为历来的新高。患者通常有发烧、呕吐、眼黄及尿液呈茶色等病征，报道同时指出，戊型肝炎患者多曾去过高危地方，或曾食用贝或猪肝等食物，以致染病。虽然两则报道相距7年，但在这7年里，世界各地尤其是发展中国家类似的报道数不胜数。这提示我们戊型肝炎病毒正隐蔽在家畜、家禽及野生动物体内，并悄悄地“潜伏”在我们周围。

戊型肝炎是引起暴发性及散发性肝炎的主要原因，血清学调查表明［2］，世界1／3人口曾经感染过戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus，HEV）。无论是在发展中国家还是在发达国家，戊型肝炎都不再是一种罕见的疾病，在发达国家每年约有1．3万～2．6万人慢性肝炎患者因合并HE死亡［3］。戊型肝炎具有比较明显的年龄特异性，对于老年人、慢性肝炎患者及孕妇危害性尤高，孕妇感染HEV的死亡率可达20%［4］。众多研究表明，猪HEV可能是人感染HEV的主要来源之一，因此，积极开展动物源性HEV的研究将会对公共卫生及动物源性食品安全的实施具有巨大的帮助。

1 猪戊型肝炎病原学与流行病学

HEV属于单股正链RNA病毒，是戊肝病毒属的惟一成员。目前已经鉴定出两种截然不同的HEV，一种是感染哺乳动物的HEV，包括4个基因型，可以引起人类的急性肝炎，目前认为猪及其他多种动物可能作为其重要的储存器；一种是感染禽类的HEV，只含有1个基因型，可引起鸡出现肝脾肿大症状。其中前者，被认为可能是一种猪源的人兽共患病，也是目前动物源性人兽共患病的研究热点之一，该病毒具有一个7．2kb的基因组，含有3个开放阅读框（ORFs），分别为编码具有复制功能的多聚蛋白的ORF1、编码病毒衣壳蛋白的ORF2以及编码具有调节细胞蛋白激酶活性的ORF3。

根据病毒基因的变异性，我们将感染哺乳动物的HEV分为4个基因型［5］：分别是以亚洲和非洲分离株为主的Ⅰ型；以墨西哥株及少量非洲散发疫区分离株为主的Ⅱ型；以分离自发达国家并可以是人源或猪源分离株为主的Ⅲ型；以亚洲分离株为主，尤其是主要发现于中国及日本的基因型Ⅳ型。

目前在我国大部分地区［6－8］，不但在人群中可以检测到高比例HEV阳性血清的存在，同时在家畜（猪、马、牛、羊）及宠物（犬）体内同样可以发现高比例的HEV阳性血清，特别是在猪群中感染率尤为明显，但HEV RNA阳性率却远远低于其血清阳性率。通过对我国分离到的病毒测序比对发现，无论是人源还是动物源的HEV大多数属于Ⅳ型。而且对我国东部及南部的分离株分析发现，猪HEV与人HEV具有较高的相似性。因此有学者推测，猪可能是HEV重要的储存器［9］，并通过污染水源［10］和食品［11］，作为一种人兽共患病病原在猪群及人群中自由传播。通过对我国部分地区，如我国上海、北京、湖南、广西及内蒙古等西部省份不同猪群调查表明，不同日龄、不同养殖方式的猪群中HEV阳性血清均维持在一个较高水平，3月龄以上猪群感染率高于三月龄以下猪群［4］，散养猪群血清阳性率尤高，在北京部分散养猪群中阳性率可达90%以上［12］。因此可以推断，我国大多数地区的大多数猪群均有过HEV的感染经历，而且部分猪群正处于隐性感染阶段。

尽管自然感染HEV猪群很少出现典型的临床症状或发病，但我国不同猪群HEV高感染水平的现状我们不能够忽视，因为猪群具有潜在的作为HEV储存器的能力。同时有研究表明，猪HEV可能跨种间传播给人类，因此针对猪HEV的展开深入的研究，对于公共卫生、器官移植及动物源性食品安全有着重要的意义。

2 猪戊型肝炎诊断方法

猪HEV具有跨宿主传播给人类的可能，对该病毒进行及时有效的诊断十分重要。目前实验室常用的猪HEV诊断方法有PCR、ELISA、免疫组化、原位杂交及其他分子生物学和免疫学方法。

2．1 用于猪HEV检测的PCR方法 由于猪HEV属于单股正链RNA病毒，因此实验室最早采用RT－PCR方法进行该病原的检测，Huang等［13］针对病毒ORF2段基因设计引物扩增出大小为392 bp的产物，用于RT－PCR的检测，该方法不但可以进行的病原的检测，而且序列分析表明，美国猪HEV流行株与美国人HEV流行株具有高于79%的相似性。另外一种PCR方法为巢式RT－PCR（nRT－PCR），Choi等［14］最早设计两对引物对福尔马林固定的肝脏进行了猪HEV的检测，试验方法具有很好的特异性，目前该方法在很多实验室中被广泛应用。随着实时定量PCR方法（Real－Time PCR）的不断改进和完善，在猪HEV检测技术中又相继出现了 SYBR GreenⅠReal－Time PCR［15］和TaqMan Real－Time PCR［16］方法，这些方法不但有高于nRT－PCR的灵敏性，而且可以用于多重检测方法的建立。为建立一种灵敏可视化PCR检测方法，本人所在研究团队建立了环介导等温扩增技术（Loop－Mediated Isothemal PCR，LAMP）用于该病毒的检测，试验方法具有与nRT－PCR相同的灵敏性，可有效的用于临床样品的检测（研究结果未发表）。

2．2 用于猪HEV检测的ELISA方法 由于HEV病毒血症持续的时间较短，在流行学病调查中单独使用PCR检测结果，会造成结果的片面性，因此常常采用酶联免疫吸附试验（ELISA）用于HEV抗体的检测，以对PCR检测结果进行补充。Engle等［17］将猪HEV和人HEV重组ORF2蛋白用于ELISA方法的建立，尽管二者在氨基酸序列上存在5%的差异性，但试验结果表明，二者可同时用于猪和人HEV抗体的检测，这表明两种HEV在OFR2段可能存在相同的抗原决定簇。Hu等［18］通过对猪HEV ORF2基因进行序列分析，发现在其394～660bp之间集中存在病毒的构象表位，因此将其表达后包被于固相载体上，并结合应用该蛋白过氧化物酶标记产物，建立了双抗原夹心ELISA检测方法用于HEV抗体的检测，该方法不但具有较强的灵敏性和特异性，而且可以用于HEV感染后14d血清的检测。另有研究表明，应用Ⅲ型HEV杆状病毒重组衣壳蛋白也可以有效地用于其血清的检测［19］。

目前，国内有使用国外进口猪HEV ELISA试剂盒用于国内猪血清检测的报道，国外ELISA试剂盒中包被抗原多为Ⅱ型或Ⅲ型HEV，与目前国内主要流行Ⅳ型HEV在基因型存在较明显的差别。虽然国外进口猪HEV ELISA试剂盒用于国内猪血清检测时可以检测到阳性血清的存在，但其结果是否能够客观反映流行水平，还有待进一步讨论。

2．3 用于猪HEV检测的免疫组织化学和原位杂交方法 免疫组织化学法和原位杂交检测方法可以用于检测病原的组织分布，甚至检测其在细胞内的定位。Chio［20］等人首先应用一段长度为289bp的地高辛标记的cDNA探针对自然感染HEV病猪的肝脏及其他组织进行了检测，结果发现，在肝脏及胆管内可以见到阳性信号的分布，同时在小肠、大肠、脾脏、淋巴结、扁桃体及肾脏中也发现了阳性信号的分布。Ha等［21］最早应用免疫组化方法对PCR检测为阳性，且为福尔马林固定的自然感染病例样品进行了HEV的检测，检测结果与Chio得到结果一致。二人的研究结果表明，猪HEV主要分布于肝脏的肝细胞，同时在肝外组织也可以见到少量的分布。另有研究应用原位杂交技术表明，在变性及空泡化的肝细胞内不能发现杂交信号的存在［22］，这提示我们HEV感染猪后仅能引起肝细胞发生轻微的病理变化，并使其处于亚临床症状阶段。

2．4 其他方法 HEV是一种基因型比较复杂的病毒，不同国家和地区的不同毒株都可能存在一定差异。对湖南猪HEV流行毒株进行序列分析结果表明，多数属于Ⅳ型，但也存在其他基因型的可能［7］。一直以来多应用序列分析的方法进行分子流行病学分析，这种方法稍显费时费力。针对这种情况，并结合HEV基因特点，Sun等［10］采用异源双链迁移分析方法（heteroduplex mobility assays，HMA）用于区分猪HEV野毒株和参考毒株，这种方法不但适用于HEV分子流行病学的测序前调查，对于其他基因型复杂的病毒应该同样有效。另外，在检测方法方面，本研究团队最近建立了免疫过氧化物酶单层细胞试验方法（immunoperoxidase monolayer assay，IPMA），将稳定表达 HEV ORF2蛋白的细胞系包被于固相载体上，用于其抗体的检测，该方法在实验室应用取得了较好的效果（研究结果未发表）。

3 猪戊型肝炎病毒感染模型及感染途径

目前无论是人HEV还是猪HEV研究面临的最大问题是，还没很好细胞系能够对其进行稳定的传代培养。但最近有研究显示［23］，猪和人的某些细胞系能够用于猪Ⅳ型HEV的传代，研究结果表明，用猪肛门拭子和肝脏接种猪肾细胞系（IBRS－2）和人肺癌细胞（A549），当IBRS－2传代至第8代、A549传代至22代时，可以见到细胞病变的出现，该研究结果为今后HEV体外试验的开展提供了重要信息。

体内试验对于HEV的研究同样重要，尽管目前猕猴可以用于HEV的研究［24］，但由于猴子饲养难度较大，大多数实验室还无法正常采用。为寻找猕猴的替代动物，有人使用蒙古沙鼠（Mongolian gerbils）作为动物模型开展的Ⅳ型HEV的研究，试验结果表明，该实验动物通过腹膜内感染病毒后，病毒血症和粪便排毒可以持续接近4周，同时在肠道和肝脏内检测到病原的存在［25］。

深入了解HEV的传播途径对预防、控制病毒的传播和扩散有着重要的意义。在实验室中静脉注射途径是一种比较广为使用的办法，同时有人还采用肝内接种的办法，这两种感染途径都可以获得很好的感染效果。但在自然情况下HEV会以哪种途径进行相互感染呢？有研究表明［26］，“粪－口”传播是一种重要的方式，而通过“针头”和扁桃体进行传播的可能性则较小。另有试验指出，当猪口服含有适量病毒的胆汁时，可以使部分实验动物感染病毒，更重要的是还可以使与之直接接触的“哨兵”动物感染［27］。以上这些信息提示我们，做好粪便清理工作和及时隔离疑似动物，对做好HEV的防控尤为重要。

4 小结

猪HEV是一种发现比较晚的病原，尽管国内外学者对其进行长期的研究，但仍留给我们较多的空白，例如主要抗原表位的分布、免疫机制与致病机制的具体途径等。开展猪HEV研究最重要的原因是，该病原可以在多种动物之间传播［28］，尤其是可能跨宿主感染人类，并在一些人群中出现高水平的致死率。预防该病原在人猪之间以及人与其他动物之间相互传播的关键环节是控制传染源并切断传播途径。研究表明，带毒动物可以通过粪便污染水源及水生生物，进一步传播给人类。因此，如何加强动物粪便的管理，如何提高水质监测水平，以及如何避免食品源性动物受到病毒的污染，对今后的研究和监管都显得格外重要。由于猪感染HEV较少发病，因此猪HEV疫苗的研究始终没有明显的进展，但可喜的是人HEV疫苗研究已经进入了3期临床试验阶段，并取得了很好的效果［29］。在器官移植研究中有人尝试使用猪的器官替代人的器官，因此猪HEV给异源器官移植同样带来了潜在的危险。但随着HEV诊断技术的不断优化、传播途径不断明确以及相关疫苗的研发，我们有理由相信，HEV在不同种属动物之间的传播会得到有效的控制，猪HEV在公共卫生、食品安全以及器官移植等领域带来的问题会得到合理的解决。

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