几种常见食用菌胞外酶活性测定方法的研究1）

吕春鹤，孙婷婷，张健，孟东阳，邹莉

（东北林业大学 林学院，哈尔滨 150040）

食用菌在生长发育过程中产生胞外酶，食用菌胞外酶可以分解培养料使多糖、蛋白质、核酸等天然高聚物裂解成食用菌菌丝和子实体便于吸收的小分子物质，为食用菌菌丝生长、原基形成、子实体生长发育提供营养物质［1］。因此，食用菌胞外酶在食用菌生长发育过程中起着至关重要的作用，其胞外酶的酶活力也就成为了重要的测定对象。通过对酶活的测定可以清晰地看出各种胞外酶对菌料的分解程度与分解效率，以便于使食用菌菌丝及子实体更好更快生长。并且就食用菌的生长发育过程来看，了解食用菌胞外酶活性的变化趋势，可以进一步探究食用菌的营养生理，提高栽培技术。在食用菌胞外酶中，羟甲基纤维素酶、淀粉酶、漆酶、蛋白酶、多酚氧化酶、半纤维素酶等均对食用菌生长起着很大的作用［2－8］，但其中最为主要的酶有羟甲基纤维素酶、淀粉酶、漆酶。所以下面将会对这几种酶的测定方法进行主要分析。

1 漆酶

漆酶属于多铜氧化酶家族中的一大类，利用分子氧通过自由基－催化反应机制来氧化各种芳香族和非芳香族化合物［9］，是一种糖蛋白。是与木质素等大分子物质降解有关的酚氧化酶，它能加速木质素芳香族化合物的分解，为菌丝提供营养。胞外漆酶活性越高菌株分解木质素能力就越强。目前测定漆酶酶活的方法有分光光度法、测O2法、高效液相色谱法、极谱法、脉冲激光光声分析法、微量热法等。其中最常用的方法为分光光度法，而在分光光度法中比较常用的有邻联甲苯胺法，ABTS法，愈创木酚法等。因为不同来源的漆酶与底物反应的亲和力不同，即使同一来源的漆酶，底物不同，反应的亲和力也不同，测得的酶活数值就不同。因而，目前也没有统一的方法来测定漆酶酶活。以下总结了最常用的分光光度法中的几种常见方法并进行了比较分析。

1.1 邻联甲苯胺法

邻联甲苯胺法测定漆酶酶活是以邻联甲苯胺为底物，以醋酸溶液反应体系为缓冲溶液，pH值为4.0或4.6，缓冲溶液的浓度有0.039、0.077、0.085 mol／L 3种。反应温度可选择在25、28、30、40℃，反应时间与反应温度有关，30℃和40℃一般反应5min，25℃和28℃一般反应30min，分光光度计波长一般在600nm。邻联甲苯胺容易购买且价格相对ABTS便宜，可选择的反应温度多，在30和40℃时反应时间短，但邻联甲苯胺毒性较强，且该底物水溶性差，所以测定的酶活力低。

1.2 ABTS法

ABTS法是最常用和使用最广泛的漆酶酶活测定方法。其酶活反应的底物为ABTS（3－乙基苯并噻唑－6－磺酸），ABTS经漆酶作用后形成ABTS自由基，ABTS的浓度在0.1～5mmol／L，常用0.5mmol／L反应的缓冲体系为醋酸溶液反应体系，pH值一般在4.0～5.0，常用pH值为5.0，反应一般在室温下（25℃）进行，但有时为了防止过氧化氢［10］的影响也会选择在较高温度下反应。分光光度计的波长一般为420nm［11－12］，也有报导用波长为436nm［13］测吸光度。

虽然ABTS市场价格较高，但漆酶对ABTS的亲和力强，反应催化能力高，ABTS为底物测漆酶活性反应灵敏度高，因为ABTS是直接测定产生的ABTS阳离子自由基，ABTS离子自由基在水溶液中比较稳定所以测出的OD值也精确，因此该方法为测定漆酶酶活较实用、较精确的方法。

1.3 愈创木酚法

反应底物为愈创木酚，底物的3种常用终浓度为0.4、0.8、1.0mmol／L。缓冲溶液常用琥珀酸钠溶液，pH 值一般为4.5，浓度为0.05mol／L，也有用磷酸钠缓冲溶液的。反应一般在30℃下反应30min，分光光度计波长为465nm［17］。

漆酶在作用于愈创木酚时产生的物质由于不稳定可转化为多种形式，有醌类物质、聚合物和C－O，C－C偶联产物［14－16］，由于只是在某波长下测定产物醌类物质的数量来计算酶活，所以最后测定的酶活不准确（偏低）。醌类物质的量不确定，酶活测定也存在不稳定性，且此种方法反应时间过长。

根据国外的文献报道，常用ABTS法或丁香醛连氮法测定漆酶酶活，国内常用ABTS法、愈创木酚法和邻联甲苯胺法测定漆酶。

2 羟甲基纤维素酶

纤维素酶是一种复合酶，由内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶构成［18］。因此测定纤维素酶活的方法可分为纤维素酶总酶活力测定与单一纤维素酶组分的测定。对于单一纤维素酶组分的测定方法，其中以羧甲基纤维素钠盐酶活性测定方法最为常见［19］。

在测定纤维素酶总酶活力时，可选择的底物是多种多样的，有荧光定糖法、滤纸酶活（FPA）测定法等多种方法。即使这样，现代测定纤维素的方法已基本明确。下面将会介绍几种常用的测定纤维素酶酶活的方法。

2.1 滤纸酶活（FPA）测定法［20］

此方法以纤维素酶作用于滤纸后生成的还原糖量来表征纤维素酶的糖化能力。很多文献报道该方法在pH值为4.6的醋酸缓冲溶液中，与1条lcm×6cm新华滤纸（50±1 mg）在50℃下反应60min，DNS显色5min，于520nm处测定OD值，也有报道称是在530nm处测定OD值［21］。此方法较为稳定，是一种公认的、经典的方法。但此种方法由于其底物滤纸是不溶性的，结构比较复杂，且影响因素较多，耗时较长［22］，所以大部分实验室对其进行了改良。此方法更适于高酶活的样品。

2.2 羧甲基纤维素钠盐酶活性测定方法［20］

纤维素酶作用于CMC－Na，使其降解，生成纤维二糖、葡萄糖等还原糖，在碱性条件下能将3，5－二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，用标准葡萄糖溶液作标准液，22PC分光光度计在520nm处测其吸光度，以每分钟生成相当于1μmol的葡萄糖为一个酶活性单位［23］，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。反应应在pH值为4.6的醋酸－醋酸钠缓冲液中进行，于50℃水浴锅中反应5min，加入DNS沸水浴反应5min后测定OD值。生成棕红色的氨基化合物。以羧甲基纤维素为底物测得的酶活值比以滤纸为底物测得的酶活值高，这说明酶对水溶性底物有较高的活力，同时也表明，吸附对酶的活性部位与纤维素分子链段的结合及催化均有很大影响［21］。于是，干宁、徐伟民等提出了用SiO2凝胶包埋葡萄糖氧化酶（GOD）电化学传感器（GOD／SiO2）测定羟甲基纤维素酶活性的方法，此方法用SiO2包埋葡萄糖氧化酶，使其生物活性不被破坏且分布均匀。此种方法操作简单、灵敏度高［19］。

2.3 荧光定糖法［24］

荧光定糖法是通过测定生成的还原糖与反应液生成荧光物的荧光强度来表征纤维素酶的酶活力。据报道称荧光定糖法测定纤维素酶活力的最佳背景体系 为 46.7mg／g 乙醇胺 ＋46.7mg／g 硼酸 ＋50mmol／L柠檬酸，反应体系为以46.7mg／g乙醇胺＋46.7mg／g硼酸＋50mmol／L柠檬酸＋20μg葡萄糖，反应时间为10min，反应温度为150℃。此种方法简单快速，专一性强，具有较高灵敏度，适于纤维素酶活力的大量样品的测定，但此方法更适于低浓度纤维素酶活力的测定。

3 淀粉酶

淀粉酶是α－淀粉酶、β－淀粉酶及葡糖淀粉酶的总称，一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α－1，4－葡聚糖，水解α－1，4－糖苷键的酶。根据酶水解产物异构类型的不同可分为α－淀粉酶与β－淀粉酶。微生物中主要的两种淀粉酶为α－淀粉酶及葡糖淀粉酶。测定淀粉酶的方法有很多种，如碘－淀粉比色法、3，5－二硝基水杨酸比色法（DNS法）等。

3.1 碘－淀粉比色法

淀粉经α－淀粉酶催化水解，生成产物为葡萄糖、麦芽糖及糊精，在底物淀粉浓度已知且过量的条件下，反应后加入碘液与末被催化水解的淀粉结合成蓝色复合物。将其蓝色的深浅与未经酶促反应的空白管比较，从而计算出淀粉的量，推算出淀粉酶的酶活力。此反应应在pH值为7.0、酶底物淀粉浓度为0.4g／L的缓冲液的体系中进行，在40℃下和底物淀粉作用30min，于660nm波长处测定吸光度值［25］。碘－淀粉比色法测淀粉酶活力具有操作简便迅速、实用等优点，但此方法也有重复性差，准确率低等缺点［26］。

3.2 3，5－二硝基水杨酸比色法（DNS法）［27］

此法是用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量来表征淀粉酶的酶活力。反应是在pH值为5.6的柠檬酸缓冲液中进行，取柠檬酸淀粉缓冲液与淀粉酶混匀，于60℃水浴中保温30min，将酶液与显色剂DNS于40℃水浴中5min，于520 nm波长下测吸光度值，然后计算酶活力。在DNS比色法中，所用试剂易得，溶液有效期长，精确度高，结果较为稳定可靠都是此方法的优点，但相对于碘－淀粉比色法它的操作则较为复杂。

4 小结与展望

随着人们对食用菌胞外酶研究的不断深入，测定酶活的方法也越来越多。但因各种测定方法均各有利弊，所以我们需要根据不同的情况，来具体讨论采用何种方法测定酶活。不同的酶活力测定方法，因反应机制不同，反应时间不同，同种酶活性不同，导致不同研究者和不同文献中对同一种酶的酶活测定也无法进行分析比较。因此，将各种酶活力测定方法进行归纳整理很有必要，可以让研究者有一个更有价值和科学的方法来分析比较。但无论方法怎样多变，各种酶活的测定方法都将会朝着操作简便、快捷、高灵敏度方向发展。

综上所述，自胞外酶被人们研究利用以来，其各种酶的酶活测定方法就不断涌出，但自动化测定酶活的方法还是占据了小部分，随着科技的进步，复杂繁琐的人工测定酶活的方法终将会被简便的自动化方法所取代。精密仪器的使用也会越来越普遍。更好的测定方法会使得测定出的数据结果更加准确可靠，使得科学研究、应用生产等工作更加顺利的进行。

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