特殊染色及免疫组化双重染色在恒河猴糖尿病模型中的应用

朱 华，徐艳峰，黄 澜，刘 颖，秦 川

(卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，中国医学科学院医学实验动物研究所，北京协和医学院比较医学中心，北京 100021)

随着人民生活水平的提高，糖尿病的发病率也逐年升高。但其病因和发病机制尚未完全阐明。糖尿病的防治已成为科学工作者的一个重要课题。研究资料表明，本病与遗传、环境及免疫等多种因素有关。研究糖尿病的发病机制和抗糖尿病药物的作用都需要建立合适的动物模型。对糖尿病动物模型的评价除血糖、C胎、胰岛素、血生化等常规指标，胰腺、肾脏等受侵害组织的病理学观察也是评价模型成功与否的重要指标。本文在使用小剂量多次注射链脲佐菌素(STZ)的方法成功诱导恒河猴糖尿病动物模型的基础上，用特殊染色、免疫组化双染的方法显示胰腺等组织中的特征性病变，现介绍如下。

1 材料和方法

1.1 动物模型

成年雄性恒河猴5只，购自军事医学科学院实验动物中心，年龄4～6岁，体重5.5～6.5 kg。动物合格证号［SCXK-(军)2007-001］。动物使用许可证号［SYXK(京)2010-0030］。模型制作方法见参考文献［1］

1.2 切片制备

动物血糖逐渐升高，经长期观察，在濒死状态时股动脉放血处死。取胰腺、心脏、肾脏、脾脏、肝脏、眼球、脑等器官，10%中性甲醛液固定，组织经常规脱水，石蜡包埋，进行连续切片，厚度4 μm。

1.3 染色方法

1.3.1 HE染色:所有切片均进行 HE染色，根据H．E染色结果对分别对胰腺、肾脏、脾脏、肝脏等进行Masson三色染色、PAS、甲苯胺蓝、天狼星红染色。染色方法见参考文献［2］。

1.3.2 免疫组化双重染色:切片经脱蜡、水化、蒸馏水洗，进行SP法双重免疫组化染色。具体步骤如下:(1)3%H2O2消除内源性过氧化物酶，室温10 min，PBS洗。(2)正常血清封闭15 min，滴加第一抗体混合液(rabbit anti-insulin，Santa Cruz公司产品，货 号 SC-9618，稀 释 度 1∶300;mouse antiglucagon，福建迈新，货号 BM1621，稀释度 1∶200)，4℃过夜，PBS冲洗。(3)滴加第二抗体混合液(辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG聚合物，碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG聚合物等比例混合，北京中杉金桥，货号 DS-0001)，室温孵育 30 min，PBS冲洗。(4)DAB显色1～5 min(北京中杉金桥，货号DS-0001)，显微镜下控制显色程度，蒸馏水终止显色。(5)AP-red显色(北京中杉金桥，货号 DS-0001)5～10 min，镜下观察显色程度。(6)苏木素衬染后甘油封片。

2 结果

2.1 HE及特殊染色

模型动物的胰岛萎缩，数量减少，胰岛内细胞排列紊乱，部分胰岛细胞固缩，细胞体积缩小，胞浆浓缩红染，胞核圆形深染(图1A)。Masson染色外分泌部间质内纤维增生，灶状腺泡萎缩(图2E)。间质大血管壁平滑肌增厚，血管周围结缔组织增生。视网膜神经元变性、数量减少、排列紊乱(图1C)。脾脏白髓萎缩(图1D)，天狼星红染色可见中央动脉管壁增厚(图2D)。局灶性慢性肾炎，病变区肾间质纤维组织增生，少量炎细胞浸润，肾小球及肾小管萎缩。部分肾小管扩张。肾脏内小动脉管壁增厚个别肾小球球囊腔消失，脏层及壁层上皮细胞融合，毛细血管腔闭锁。(图1E，F;图2B)。心内膜小灶性炎细胞浸润(图1B)。肥大细胞脱颗粒(图 2F)。

2.2 免疫组化染色

胰岛A细胞增生，细胞密集，胰高血糖素表达增多，胞浆呈棕褐色，细胞核蓝色。B细胞数量减少，胰岛素表达减少，胰岛细胞分布杂乱，胞浆粉红色，细胞核蓝色(图3，图1～3见文后彩插1～2)。

3 讨论

糖尿病模型研究需要形态学提供直观的结果支持。而形态学研究在很大程度上依赖于通过染色显示出各脏器的病理变化。常用的苏木素-伊红(HE)染色，只能显示一般组织结构及病变，但一些特异的组织成分、化学物质等，则需要用特殊染色方法进行分析与鉴别［3］。免疫组织化学问世后，组织和细胞中大部分化学成分和一些反应基团都可以用免疫组织化学方法进行检测，许多特殊染色方法被免疫组织化学染色所替代［4］。但特殊染色具有定性准确、方法简单、结果可靠的特点，在科研工作中做对比观察可起到相互印证作用［5］。如胶原纤维在HE染色中呈均一的粉红色，与周围间质区分不是很清楚。网状纤维在HE染色中不易显色。HE染色中也无法显示细胞中糖原颗粒的沉积。而STZ诱导的I型糖尿病的主要病理改变之一即胰岛纤维化和糖原堆积引起的肾小球基底膜增厚继而导致肾小球硬化症［6］。本研究在 HE染色基础上，通过Masson三色染色法显示胰岛及胰腺外分泌部中增多的网状纤维，通过天狼猩红染色显示脾脏胶原纤维增多导致动脉管壁增厚，用PAS染色法显示肾小球系膜基质增生，基底膜增厚，取得了满意效果。

胰腺内分泌细胞损伤时形态学上主要表现为胰岛萎缩、B细胞凋亡，细胞数量减少，残存B细胞肥大代偿，A细胞增生。要观察模型动物胰腺A、B细胞情况，普通HE染色切片无法辨别，而单一的免疫组化染色因切片的不一致，观察结果存在一定主观性。本研究采用免疫组化双重染色技术，在同一张切片上显示A、B细胞分泌颗粒的表达情况，结果与文献报道一致［7］。在染色过程中对实验步骤进行优化，采用不同众种属来源和标记系统的一抗和二抗混合孵育，分别显色，与一抗、二抗单独反应相比，大大减少了操作时间而并不影响反应结果。但要注意显色时要先用DAB对辣根酶进行显色，再用AEC对碱磷酶显色。因为AEC为较浅的粉红色，且显色时间较长。如果先显色，易被较深的棕色DAB所覆盖。

本文在使用STZ成功诱导恒河猴糖尿病动物模型后，利用HE染色结合能体现糖尿病特征性病理改变的特殊染色和免疫组织化学双重染色法可更好的对模型进行组织病理学评价，为模型的应用提供参考。

［1］ 朱华，刘颖，马春梅，等．STZ诱导恒河猴糖尿病动物模型的建立［J］．中国比较医学杂志，2012，22(6):53－56．

［2］ 潘琳．实验性糖尿病病理图谱［M］．北京:科学出版社，2007:187－194．

［3］ 高美钦，袁芳平，黄爱民，等．弹力纤维染色与免疫组织化学双重染色技术［J］．中华病理学杂志，2003，32(2):176－177．

［4］ TaylorCR． The totaltestapproach to standardization of immunohistochemistry［J］．Arch Pathol Lab Med，2000，124(7):945－951．

［5］ 胥维勇．现代病理学条件下特殊染色的应用价值［J］．实用医技杂志，2012，19(3):313－314．

［6］ Kenneth NL，William TC，Janice DW．Streptozotocin-induced diabetes mellitus in cynomolgus monkeys: changes in carbohydrate metabolism，skin glycation and pancreatic islets［J］．Lab Anim Sci，1998，48(2):172 －178．

［7］ Wagner JD，Carlson CS，O＇Brien TD，et al．Diabetes mellitus and islet amyloidosis in cynomolgus monkeys［J］．Lab Anim Sci．1996，46(1):36－41．