银屑病皮损组织端粒DNA长度的定量研究

王大虎 马喜兴 李艳玲 马耀辉 李玉平 四荣联

(河北医科大学第二医院皮肤科，河北 石家庄 050000)

端粒(telomere)是位于真核细胞线性染色体末端的特殊结构，由简单的DNA串连重复序列和一系列相关的蛋白质组成。端粒作为分子钟控制着人类细胞的复制与衰老，随着正常体细胞细胞增殖，端粒酶(telomerase)活性缺如，导致DNA合成的后随链不能有效的复制出染色体3'末端，其端区长度逐渐缩短。当其长度减小到一定的临界值时就失去了保护染色体末端的功能，细胞即趋向于衰老、死亡〔1〕。正常细胞内检测不到端粒酶活性，只有在某些特殊细胞中才能检测到，包括造血细胞、淋巴细胞、皮肤细胞以及生殖细胞等具有增殖潜能的细胞〔2〕。近来研究发现，尽管端粒酶活性主要在大多数肿瘤中表达，但在某些非恶性皮肤病如银屑病皮损和常青藤诱发的皮炎中也有表达的迹象〔3〕。本研究测定银屑病皮损中端粒DNA长度的表达情况。

1 材料与方法

1.1 标本来源 所有标本均来自河北医科大学第二医院皮肤科门诊和住院手术取病理活检患者30例，经临床及病理确诊为寻常型银屑病患者，分别取病损和病损旁皮肤。其中斑块状23例，点滴状7例。对照组为来自外科整形术的非暴露部位正常皮肤30例。患者皮损经手术切取后，一部分送常规组织学检查，另一部分立刻固定于70%乙醇溶液用于流式胞术检测。

1.2 主要试剂 端粒肽核酸(PNA)探针试剂盒系DAKO公司产品。

1.3 原位杂交 实体组织单细胞悬液制备后，取2×106个细胞，分为实验组和背景对照组;实验组加入300 μl含 FITC-(CCCTAA)3PNA探针杂交液，对照组加300 μl空白杂交液，混匀，87℃避光孵育15 min变性;室温避光过夜杂交;加入1 ml洗液(1∶10 稀释)，混匀4℃孵育10 min，1 500 r/min 离心3 min，弃上清，重复1次;DNA染色加，入0.5 ml PI染液(1∶10稀释)，混匀，4℃避光孵育2 h，400目铜网过滤后进，行流式细胞仪测定。

1.4 流式细胞仪检测方法 采用美国Beckman Coulter公司生产的Epics2XLⅡ型流式细胞仪，激发光源为15 mW氩离子激光器，激发波长为488 nm。检测前以flow-check TM Fluorpheres(10 μm)荧光微球(REF6605359，Beckman Coulter，Inc.Fullerton，CA 92835)作为标准样品，调整仪器 CV值在 2%以内。

FL1通道检测FITC荧光强度，FL3通道检测PI荧光强度，端粒荧光定量即Q-FISH值由减去背景后的G0/G1期二倍体细胞平均荧光强度所决定。Q-FISH值=实验样品平均荧光强度-背景对照平均荧光强度。

1.5 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件包行t检验。

2 结果

2.1 端粒DNA长度在银屑病皮损中的表达 FCM检测的QFISH值分别为28.87±6.57、35.89±8.13和52.46±7.95，银屑病皮损组端粒长度明显短于正常皮肤组(P＜0.01)，银屑病皮损旁皮肤组端粒长度明显短于正常皮肤组(P＜0.01)。

2.2 端粒DNA长度变化与病变程度相关性分析 Spearman等级相关分析显示，端粒长度与病变程度呈负相关(r=-0.76，P＜0.01)。按照Q-FISH值小于正常组端粒长度80%(＜0.76)为缩短，大于正常组织120%(＞1.14)为延长的标准划分，从银屑病皮损旁皮肤组到银屑病皮损组端粒缩短的阳性率分别为40.00%(12/30)和73.33%(22/30)，呈上升趋势(P＞0.05)。

3 讨论

银屑病(Psoriasis)俗称牛皮癣，好发于头皮、四肢伸侧及背部。以红斑鳞屑为基本表现，病理表现为表皮细胞的过度增殖和分化。是一种临床常见的炎症性、难治性皮肤病，发病率约2% ～3%。在细胞的过度增殖和分化这一特点上，银屑病和肿瘤，尤其是恶性肿瘤，有类似和相近的特征。研究表明，正常细胞的生长依赖于细胞周期中各种调节因子的调控，任何一种调控因子发生紊乱都将导致细胞增殖异常，诱发银屑病、肿瘤〔4〕。临床上可以见到由初发的银屑病转变为肿瘤，但是其具体发病机制如何，相关文献中并没有太多的阐述。

大量研究证实人体大多数癌和其他恶性肿瘤中均能检测到端粒酶活性，而良性肿瘤和正常组织体细胞(非生殖细胞)缺乏或存在微弱的端粒酶活性。由于端粒酶活性也可以在炎症性皮损中检测到，这说明端粒酶活性并不总是与恶性表型有关。这方面的研究涉及最多的疾病是异位性皮炎(AD)和银屑病，尽管在非恶性病变中的端粒酶活性较恶性病变者低得多〔5〕。在非恶性皮肤病皮损中测得端粒酶活性，提示非恶性的上皮细胞亦可有一定的端粒酶活性的激活，并推测与引起病理改变的表皮增生有密切关联。但其机制还不清楚，即在此种情形下端粒酶的表达又是通过何种途径而激活还不得而知。

正常细胞在致癌因素作用下，转变为恶性细胞并不意味着一定能形成肿瘤，哺乳动物体内有一套精细的调节机制控制着细胞的分裂次数，使细胞分裂达到一定程度后死亡。在一些肿瘤中已观察到，染色体末端的端端融合在肿瘤形成相关基因的不稳定性中起着重要作用，而这种融合可能起因于染色体末端长片段的丢失，如端粒的丢失〔6〕。基于这种观点，笔者推断端粒的缩短可能引起DNA的不稳定，激活端粒酶活性而合成端粒DNA加到染色体末端，从而抵消了细胞分裂导致的端粒DNA消耗，并在银屑病等疾病的形成中起着重要作用。

本研究初步证实，在银屑病皮损中存在着端粒长度的改变，其表达的强弱与病变进展程度有关，提示端粒长度的改变参与了银屑病的发生。

1 Shay JW，Zou Y，Hiyama E.Telomerase and cancer〔J〕.Human Mollar Gene，2001;10:677-85.

2 Cong YS，Shay JW.Actions of human telomerase beyond telomeres〔J〕.Cell Res，2008;18(8):725-37.

3 Baerlocher GM，Mak J，Tient，et al.Telomere length measurement by fluorescence insitu hybridization and flow cytometry:tips and pitfalls〔J〕.Cytometry，2002;47(2):89-99.

4 Jurisic D，Kirin I，Rabic D，et al.The role of telomerase activity in psoriatic skin lesions〔J〕.Med Hypotheses，2007;68(5):1093-5.

5 Queiro R，Alperi M，Alonso-Castro S，et al.Patients with psoriatic arthritis may show differences in their clinical and genetic profiles depending on their age at psoriasis onse〔tJ〕.Clin Exp Rheumatol，2012;30(4):476-80.

6 Tamayo M，Mosquera A，Rego JI，et al.Differing patterns of peripheral blood leukocyte telomere length in rheumatologic diseases〔J〕.Mutat Res，2010;683(1-2):68-73.