蜜蜂（Apis mellifera）美洲幼虫腐臭病最新研究进展

陈 傲 孙 杰 缪晓青

（福建农林大学蜂学学院，福州 350002）

蜜蜂中最常见的细菌病为美洲幼虫腐臭病（American foulbrood，AFB）和欧洲幼虫腐臭病（European foulbrood，EFB）。近两年来发表的文献中对美洲幼虫腐臭病的研究较多，该病于1907年确定，目前广泛发生于温带与亚热带地区的几乎所有国家，给这些国家的养蜂业带来了严重的经济损失。被感染的蜜蜂幼虫在孵化后12.5天出现症状，首先体色明显变化，从正常的珍珠白变黄、淡褐色、褐色甚至黑褐色，同时虫体不断失水，最后干瘪并紧贴于巢房壁，呈黑褐色难以清除的鳞片状物。感染美洲幼虫腐臭病的蜂群如果没有得到适当的治疗，会导致整个蜂群的死亡。为了控制美洲幼虫腐臭病的发生，养蜂生产中使用各种化学药物对蜂群进行处理，但是已经有很多国家报道美洲幼虫腐臭病对一些化学药物产生了抵抗。滥用药物还会引起蜂产品污染，因此，这些化学药物的使用应该受到限制。研究美幼病的流行病学特征和防治新技术对于减少和控制病害的发生以及在环境保护方面具有重要意义。

1 病原

美洲幼虫腐臭病的病原体为拟幼虫芽孢杆菌原（Paenibacillus Larvae），是一种芽孢形式的革兰氏阳性细菌。产生的芽孢有7层结构包围，这种特殊构造使得幼虫芽孢杆菌的芽孢具有特别强的生命力，对热、化学物质等有极强的抵抗力，在高温干燥等恶劣环境下至少能存活35年。目前已知幼虫芽孢杆菌的基因型至少有5种，且不同基因型的细菌株系所导致的美洲幼虫腐臭病的流行情况略有不同。Di Pinto， Angela等（2011）对普利亚（意大利）蜂蜜和子脾中的拟幼虫芽孢杆菌的的发生和分布进行了调查。通过ERIC-PCR对拟幼虫芽孢杆菌的基因分型进行研究，产生了四种不同的ERIC带型（ERIC-A，ERIC-B，ERIC-C，ERIC-D），包括200-3000 bp范围内的片段。基因型会影响拟幼虫芽孢杆菌的感染，蜂群或蜂场的多基因型通过影响临床症状发展的类型和速度可能会增加拟幼虫芽孢杆菌感染的复杂性。不同基因型的幼虫芽孢杆菌可以通过PCR技术和16SrRNA的编码基因的限制性酶切片段多态性加以区别鉴定。

Douglas W. Dingman（2012）对从134株拟幼虫芽孢杆菌菌株中提取的基因组DNA扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，发现16S–23S rDNA基因间存在三个基因间隔（ITS）区域，意味着拟幼虫芽孢杆菌中至少有三种类型的rrn操纵子，23S rRNA基因通过I-CeuI消化显示，基因组DNA的脉冲场凝胶电泳具有7个拷贝，这显示拟幼虫芽孢杆菌基因组具有7个rrn操纵子拷贝。对拟幼虫芽孢杆菌的16S–23S rDNA的ITS区域的研究可以辅助病原的诊断。

2 流行病学特征

美洲幼虫腐臭病是由幼虫芽孢杆菌这种特殊的芽孢引起的，而不是它的营养体。幼虫孵化后48h内，即1日龄和2日龄的幼虫对拟幼虫芽孢杆菌芽孢非常敏感，不足10个芽孢就可以使蜜蜂幼虫发病，并杀死幼虫，但是侵染2日龄以上的幼虫，则需要数以百计的芽孢。早期报道称拟幼虫芽孢杆菌的孢子在蜜蜂幼虫中肠内萌发，并通过吞噬作用进入上皮细胞后快速繁殖，最后杀死幼虫。但是，最近有报道称，拟幼虫芽孢杆菌是通过细胞旁扩散途径破坏蜜蜂幼虫中肠上皮壁而进入中肠组织。Karina等（2009）报道，拟幼虫芽孢杆菌主要致病因子是一些胞外分泌的蛋白酶（PP1、PP2），研究表明，这些蛋白酶为含锌的金属蛋白酶，属典型的多聚蛋白酶。幼虫芽孢杆菌在蜜蜂群内以水平传播和垂直传播两种方式进行传播，而在群间的传播则主要是通过垂直传播。拟幼虫芽孢杆菌的这种传播方式使得它成为蜜蜂一种传染性极强的疾病。由于芽孢只要在适宜的环境下就能萌发，所以美洲幼虫腐臭病的发生没有一定的季节性，病害能在一年中的任何一个有幼虫的季节都有可能发生，但是一般在夏、秋季节发生的相对较多。

3 病原鉴定

对于拟幼虫芽孢杆菌的鉴定，早些时候一般是通过生化手段或分离培养的方式进行鉴定。由于拟幼虫芽孢杆菌生长环境的特殊性，现在主要通过PCR技术对其进行鉴定。Dobbelaere W 等（2001）发展了一种以16SrRNA编码基因片段为引物的PCR技术来鉴定幼虫芽孢杆菌的方法，实验证明该方法快速、可靠，在4小时内就能做出正确的诊断。Alippi等（2004）设计的1对引物KAT1和KAT2的特异性非常强，可以鉴别出拟幼虫芽孢杆菌的不同亚种。经过不断的完善和改进，目前PCR技术可以在蜜蜂幼虫尚未发病时检测出低浓度的芽孢，使得PCR成为目前研究美洲幼虫腐臭病的最佳选择。

4 防治

由于美洲幼虫腐臭病的危害极大，因此如何防治的问题一直受到人们的高度重视，其中抗生素为使用最多、应用最广的药物。自1944年以来，硫胺噻唑、土霉素、林可霉素、泰乐菌素、磺胺类、红霉素等抗生素相继被用于美洲幼虫腐臭病的治疗中。然而，抗生素会在蜂产品中残留，影响蜂产品的质量，给人类的健康造成威胁。除此之外，抗生素还会使蜜蜂的抗药性增强，导致病原体产生变异，使得蜂群患病更加严重。因此，寻找其他更好的药物和途径来治疗美洲幼虫腐臭病显得非常必要。Katarina等（2001）报道从蜂王浆中分离出的一个多肽片段可以做为抑制美洲幼虫腐臭病的潜在因子。2002年，Bachanova K等通过多聚酰胺凝胶上细菌生长抑制试验证实了蜂王浆中的抗菌肽抑制幼虫芽孢杆菌生长的活性。Gallardo GL等（2004年）报道从蜂房花粉中分离出的两个真菌株系L一细交链孢菌酮酸（L-Tenuazonic acid）对幼虫芽孢杆菌的生长具有特殊的抑制能力。Aronstein A等（2004）报道蒜素（Allicin）能在一定程度上抑制幼虫芽孢杆菌生长，从而减少美洲幼虫腐臭病的发生。李位三等（2008）报道从半枝莲、大黄、黄柏等中草药提取有效成分，配制成的“蜂幼康”颗粒剂对美洲幼虫腐臭病等细菌病有很好的防治作用。

2012年3月，美国食品药物管理局（FDA）批准通过了LINCOMIX可溶性粉作为治疗美洲幼虫腐臭的新药物，由美国农业部的蜜蜂研究实验室与NRSP-7进行合作对该药物进行研究，为该药物的批准提供支持，证明LINCOMIX可溶性粉在控制蜜蜂AFD时是安全和有效的。Benitez等（2012）报道幼虫芽孢杆菌LBM5006产生的一种抗菌因子可以有效地抑制拟幼虫芽孢杆菌，质谱分析表明，抗菌活性与伊枯草菌素肽类有关。Mikio Yoshiyama等（2012）从发酵物料和食物中分离出乳酸菌（LAB）研究其在活体外对拟幼虫芽孢杆菌的抑制作用，结果表明，有9种菌株抑制了拟幼虫芽孢杆菌的体外生长。通过实时RT-PCR对菌株进行筛选，将筛选出的LAB对幼虫和成蜂进行口服给药后，发现抗菌肽基因如abaecin， defensin和hymenoptaecin的转录水平显著增加。Mikio Yoshiyama等（2012）研究发现蜂胶乙醇提取物能显著抑制拟幼虫芽孢杆菌在体外生长，抑菌强度不仅与蜂胶中化合物的含量有关，与黄酮类化合的之间显著的交互影响作用也有一定的关系。Sabate，D C等（2012）研究表明甘菊花中的挥发油、己烷（HE）、和苯提取物可以抑制拟幼虫芽孢杆菌，HE表现出最高的抗拟幼虫芽孢杆菌的活性。由枯草芽孢杆菌C4和甘菊花中的HE合成的具有生物表面活性剂的表面活性素在抑制拟幼虫芽孢杆菌方面具有协同作用。

5 讨论

（1）通过PCR技术可以对拟幼虫芽孢杆菌进行快速、准确的诊断，但是在不同地区，拟幼虫芽孢杆菌存在很多不同的基因型，不同基因型的拟幼虫芽孢杆菌引起的蜂群患病情况可能有所不同，有必要通过PCR技术及DNA测序技术对拟幼虫芽孢杆菌进行基因序列分析，并绘制其基因图谱。

（2）虽然很多国家已经出台了相关法规限制抗生素的使用，但是蜂产品中抗生素超标的问题还是屡见不鲜。越来越多的研究者加入到探索对环境危害小、对人畜安全的新药物的行列中，也发现了一些能抑制拟幼虫芽孢杆菌生长的制剂和活性因子，如蜂胶乙醇提取物、乳酸菌、枯草芽孢杆菌C4和甘菊花提取物中的表面活性素等等，实验证明它们确实能对拟幼虫芽孢杆菌的活性产生抑制，但是具体是哪些活性成分在起作用，各活性成分与抑菌效果的关系，以及抑制机制等问题还有待进一步研究。

（3）如何将那些安全高效的蜂用抗菌药物使用到大规模养蜂生产中，以及药物的用法、用量、用药周期等问题还有待进一步的实践验证。

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