肺炎衣原体感染与阿尔茨海默病的关系

杨新玲，刘雪晴，杨杰民

2.云南省第二人民医院神经外科，昆明 650021

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种常见的老年神经变性疾病，临床表现为进行性认知功能障碍和精神异常。是引起老年痴呆的最常见病因。本文对肺炎衣原体（Chlamydiapneumonia，Cpn）感染与LOAD的关系作一综述。

1 淀粉样蛋白级联假说

淀粉样蛋白级联假说认为淀粉样蛋白β（amyloid－β，Aβ）的产生和沉积导致神经退化［3］，指导AD神经病理学发病机制研究已逾十年。该假说只适用于由遗传突变导致淀粉样蛋白形成和沉积的FAD，LOAD的病因学不能归于相似的或其他遗传缺陷，因此Aβ并不是所有AD的诱发因素。LOAD主要发生于65岁以上人群，年龄是LOAD发生、发展的第一危险因素。近年的研究认为，LOAD发病的其他危险因素包括动脉粥样硬化、Ⅱ型糖尿病、神经外伤和感染［1］。LOAD发病的遗传因素（载脂蛋白E－ε4等位基因）和环境因素（包括Cpn感染）之间的相互作用尚未阐明。

2 肺炎衣原体与LOAD相关的证据

2.1 组织病理学依据 肺炎衣原体是一种专性细胞内寄生的人类呼吸道病原菌，通常引起轻型或亚临床感染。在工业化社会里70%人群受Cpn影响，呈现血清阳性。Cpn急性感染主要表现为中轻度咽炎、支气管炎及重型下呼吸道感染。Cpn慢性感染与哮喘、COPD、动脉粥样硬化和AD等发病相关。Cpn慢性感染与其生物状态有关，当Cpn从活跃的复制状态转变为持续、非感染状态时，能够引起慢性炎症性疾病［4］。

1998年Balin等［5］首次报道了Cpn与LOAD之间的联系，PCR分析显示90%AD尸检脑组织呈现CpnDNA阳性，而对照组阳性率仅5%，AD尸检脑组织中衣原体16S r RNA和omp A基因显著高于对照组；免疫组织化学技术和电子显微镜检查PCR阳性脑组织样品，Cpn抗原存在于颞叶皮层、海马、顶叶皮层、前额叶皮层；Cpn主要感染神经病变的中小血管周围、神经纤维网、小胶质细胞和星形胶质细胞；LOAD脑组织电镜显示Cpn包涵体含有EB和RB；RT－PCR分析冰冻脑组织切片是否存在衣原体RNA，检测到编码KDO转移酶和Cpn特异性蛋白（约376k Da）两个转录信使，由此推测从这些组织中能够得到Cpn培养物，将PCR和RT－PCR阳性的组织匀浆与人单核细胞（THP－1）共培养，成功获得了具有活性的Cpn。LOAD脑组织分析揭示58%（11/19）PCR阳性样品含有至少一个apoE4亚型等位基因，与apoE4是LOAD发展的危险因子相一致［6］。Gerard等［7］报道 AD组80%（20/25）扩增出Cpn0695和Cpn1046两个衣原体靶基因，而对照组仅为11.1%（3/27）；免疫组织化学技术检测到Cpn与AD的两个主要病理指标淀粉样蛋白斑和NFTs具有共定位；再次从AD脑组织中培养出具有活性的Cpn；RT－PCR检测到Cpn主要的核糖体基因转录本，表明Cpn具有代谢活性。

然而，有些研究却出现不同的结果。这些矛盾的结果可能是由于不同的诊断标准和诊断工具、不同的样品材料和研究方法，也可能与诸如地理区域、死亡季节和体制历史等病人统计差别有关。有些研究使用PCR分析石蜡包埋组织，增加了DNA/RNA完整性和技术敏感性问题；有些研究在PCR分析前不知道组织是如何处理和保存的；检测CpnIg A和IgG抗体的临床意义甚小，因为老年人Cpn抗体血清阳性率较高，Cpn慢性感染也缺乏有效标志物。类似相矛盾的结果也存在于Cpn感染与动脉粥样硬化或Cpn感染与多发性硬化症之间。可以肯定的是，如果其他实验室能够再次从AD脑组织获得具有活性的Cpn将为Cpn参与AD发病机制提供有力证据。

2.2 动物模型研究 以往曾用转基因小鼠（早老素和淀粉样蛋白β前体发生突变）作为AD模型，过表达淀粉样蛋白导致大脑形成淀粉样蛋白斑，与FAD观察到的病理变化相似。但是，用这种转基因小鼠作实验研究不能阐明LOAD起始机制。要想阐明感染是如何在LOAD发病中发挥作用的，需要使用非转基因动物模型。Little等［8］报道，鼻内感染非

转基因BALB/c小鼠，随后用光学显微镜和电子显微镜检测到Cpn存在于嗅上皮和嗅球。病理分析发现大脑中Aβ1－42沉积物类似AD患者的淀粉样蛋白斑。激活的星形胶质细胞和与其共定位的淀粉样沉积物表明细胞炎症应答被激活。这种应答可能由Cpn存在引起，也可能直接针对淀粉样沉积物或由Cpn感染引起的可溶性淀粉样蛋白。有趣的是，这些结果表明Aβ的生成是对感染创伤的一种应答，支持Aβ的作用是 “生物絮凝剂”假说。非转基因BALB/c小鼠大脑中淀粉样沉积物的形成支持Cpn感染诱导或加速AD样病理，可能是LOAD发病的触发器。Hammond等［9］进一步研究了抗生素是否能够限制感染导致的中枢神经系统病变：鼻内感染Cpn后，将小鼠分为几组，分别在感染第7～21 d、第28～42 d、第56～70 d和第84～98 d用盐酸莫西沙星处理，感染6w后处死小鼠，检测大脑中Cpn、Aβ1－42沉积物和星形胶质细胞活性。免疫组织化学技术发现感染6个月后嗅觉组织和大脑中能够检测到Cpn抗原。有趣的是，最早使用抗生素处理组（感染第7－21d）Aβ1－42活性淀粉样蛋白斑数量与非感染小鼠的基线水平相同；而感染后56d才用抗生素处理组淀粉样蛋白斑数量比基线高8－9倍，接近于未使用抗生素处理的感染组。这些结果表明，感染后早期抗生素介入能够有效限制感染导致的淀粉样蛋白斑数量。

2.3 临床干预实验研究 AD感染假说成为前瞻性临床实验的基础，体外抗Cpn最有效的两种抗生素多西环素和利福平被应用在临床实验中。Loeb等［10］报道了每日给予LOAD和中轻度痴呆患者多西环素和利福平抗衣原体治疗和安慰剂对照治疗3个月，在6个月抗生素组认知功能（SADAScog）产生轻微影响（P＝0.034），在12个月抗生素组SADAScog值与安慰剂对照组没有显著差异（P＝0.079），但是在3个月抗生素组功能失调行为显著轻于安慰剂对照组（P＝0.028），在12个月抗生素组精神状态分值降低（P＝0.032）；抗生素治疗对AD患者血样Cpn－DNA阳性率和IgG/Ig A抗体滴度没有影响。但是，研究对象仅有101位AD患者和中轻度痴呆患者（51位接受治疗）严重消弱了其统计学意义，导致广泛的置信区间。体外研究表明，影响衣原体复制的抗生素不能清除血液单核细胞内持续感染的Cpn。此外，首次治疗不足或抗生素的浓度偏低反而导致Cpn持续感染。理论上，只有Cpn急性感染才必须治疗以免播散至全身系统。因此，对已经表现出临床症状的AD患者使用抗生素治疗一定会失败。另外，PCR检测AD患者血样内的Cpn－DNA来监测脑内抗衣原体治疗的效力，这种方法可能并不合适。因此，目前的研究结果无法回答抗生素治疗AD（尤其是AD早期临床治疗）是否能够防止疾病。体外实验和小鼠实验表明，金属蛋白衰减化合物（MPACs）能够促进细胞外含有淀粉样蛋白β的老年斑溶解及清除。据报道，抗原虫金属螯合物氯碘羟喹可能通过与铜和锌螯合而能够减少淀粉样斑块，目前已把氯碘羟喹作为AD临床实验潜在治疗药物［11－12］。

3 肺炎衣原体感染致LOAD的机制

3.1Cpn进入中枢神经系统 呼吸道病原菌Cpn是如何进入中枢神经系统的？衣原体最有可能通过嗅觉途径进入大脑。Cpn通常感染黏膜上皮，能够通过呼吸作用黏附到嗅觉神经上皮。PCR和RTPCR检测LOAD尸检嗅球，发现了Cpn的遗传物质［13］。有趣的是，AD一些早期病症就发生于嗅球。嗅球病变早于内嗅区，表明嗅觉损坏发生在临床AD之前［14］。继嗅球损伤之后，内嗅皮质出现神经元纤维缠结，特别是海马回内嗅皮质Ⅱ层和Ⅲ层——穿缘通路的神经投影由此产生到达神经支配的海马结构。研究发现Cpn存在于内嗅皮质、海马和颞叶皮层，这一发现把问题带入到嗅球内的感染、炎症和损伤是如何进一步导致皮层和边缘结构受损最终导致LOAD症状的。

Cpn能够被肺小血管单核细胞循环所摄取，随后通过血脑屏障进入大脑。Cpn可感染AD患者大脑神经胶质细胞、血管周围巨噬细胞和单核细胞。将人脑微血管内皮细胞（HBMECs）作为体外研究Cpn通过血脑屏障的模型，发现Cpn感染后表面黏附分子ICAM－1和VCAM－1在HBMECs中表达上调。内皮细胞表面黏附分子和单核细胞整联蛋白表达上调使单核细胞通过体外血脑屏障迁移率比非感染单核细胞通过非感染内皮屏障迁移率增大3倍［15－16］。这些研究表明，Cpn感染大脑微血管内皮和/或外周单核细胞能够促进Cpn从血液进入中枢神经系统。MacIntyre等［17］研究了感染后钙粘蛋白、连环蛋白和紧密连接蛋白在维持内皮连接完整性中的作用。细胞骨架的干扰直接影响内皮连接复合体装配，并且感染也可能与此相关。Cpn感染HBMECs导致参与连接复合体装配的一些分子表达上调，包括N－钙粘蛋白和β－连环蛋白。相反，感染导致紧密连接蛋白occludin表达下调，但是感染72 h后又会恢复。这些结果表明代偿性反应紧接感染之后；紧密连接蛋白表达下调期间，连接复合体保持屏障完整性而屏障通透性增大。随着感染72 h后occludin表达返回控制水平，这种通透性变化也发生逆转。因此，整个变化是瞬时的，而单核细胞通过HBMEC屏障的迁移率却可能增大。

Cpn引起的慢性感染和其所引起的免疫病变可能导致感染区脑细胞病变死亡。中枢神经系统中受感染的细胞将Cpn释放到细胞外液和脑脊液。Paradowski等［18］报道PCR检测AD患者、血管性痴呆患者和对照人群脑脊液中CpnDNA，发现LOAD组Cpn感染率达43.9%（N＝57），显著高于血管性痴呆组（9.5%，N＝21）和对照组（0.6%，N＝47）；LOAD患者脑脊液中CpnDNA的存在增大了疾病发病率（优势率为7.21）。

3.2Cpn与神经炎症和LOAD 衣原体引起的疾病通常是免疫发病机制的结果，激活的单核细胞和巨噬细胞存在于感染组织是慢性炎症的特征，且衣原体感染促进多种炎症前细胞因子分泌。强炎症反应由衣原体脂多糖（LPS）、热休克蛋白和外膜蛋白引起。将小剂量大肠杆菌LPS直接注射到大鼠大脑，导致以细胞因子生成和小胶质细胞激活为特征的炎症，表明LPS可以单独引起LOAD的多种病理［19］。在大鼠颞叶也发现了类似的损伤——淀粉样蛋白β诱导生成，表明由衣原体感染或宿主应答产物可能激活炎症，导致LOAD相关的神经变性。

一些临床实验表明非甾类抗感染药物能够延迟LOAD发病，这也证实炎症是LOAD的诱发因素之一；然而，这些药物却无治疗效果。大脑负责炎症的细胞主要是小胶质细胞，其次是星形胶质细胞。这两种细胞在LOAD大脑均被激活，并且存在于淀粉样蛋白斑周围和里面［20］。小胶质细胞和星形胶质细胞应答由炎症前细胞因子和活性氧族引起的损伤。Cpn存在于中枢神经系统的小胶质细胞和星形胶质细胞，表明感染所引起的炎症可能参与LOAD神经病变。体外实验结果表明，MCP－1、IL－6和TNFα等炎症前分子在Cpn感染的鼠小胶质细胞上清液中表达显著高于对照。感染的神经胶质细胞表达MCP－1和IL－6高于对照。将神经元置于感染的鼠小胶质细胞上清液中，细胞死亡显著增多；如果加入MCP－1和IL－6抗体，则神经元细胞死亡减少50%［21］。这些结果表明，Cpn感染通过激活炎症前应答导致神经变性而在神经炎症中起重要作用。

3.3Cpn与APOE和LOAD 很多与Cpn感染相关的慢性疾病都与人类19号染色体上的APOE ε4等位基因有关。Gerard等［6］等研究表明，Cpn感染参与LOAD也与APOEε4等位基因有关。原位杂交技术显示具有APOEε4等位基因的LOAD患者脑组织中Cpn感染的细胞数较多；针对Cpn染色体靶序列的实时定量PCR证实具有APOEε4等位基因的LOAD患者Cpn感染量较高。apoE（APOE ε4基因产物）是一种分泌型糖蛋白，apoE4能够增强CpnEB与星形胶质细胞和小胶质细胞等宿主靶细胞的黏附，这种黏附增强作用比apoE4缺失的对照组高3倍；有趣的是，apoE4并不能增强沙眼衣原体与宿主靶细胞的黏附作用；黏附到EB表面的apoE4仍保留与宿主真核细胞黏附的能力［22］。虽然apoE4增强CpnEB与宿主靶细胞的黏附作用细节还没有完全阐明，但是这些研究结果证明Cpn感染与APOEε4等位基因产物和LOAD之间相关联。

4 展望

病理学、动物和体外细胞学实验等研究结果从不同侧面表明Cpn感染与LOAD发生密切相关，但是这些研究主要由Balin实验室完成，其他研究者由于研究对象和研究方法等不同而得出不同的结果，结论还需其他实验室能够再次从AD脑组织获得具有活性的Cpn。另外，Cpn如何参与LOAD发病机制尚未阐明。因此，若要全面阐述Cpn感染与LOAD的关系，还有大量的工作要做。

［1］Chintamaneni M，Bhaskar M.Biomarkers in Alzheimer’s disease：a review［J］.ISRN Pharmacol.2012，2012：984786，DOI：10.5402/2012/984786

［2］Boelen E，Steinbusch HW，Bruggeman CA，et al.The inflammatory aspects ofChlamydiapneumoniae－induced brain infection［J］.Drugs Today（Barc），2009，45（Suppl B）：159－164.

［3］Schellenberg GD.Genetic dissection of Alzheimer disease，a heterogeneous disorder［J］.Proc Natl Acad Sci USA.1995，92（19）：8552－8559.

［4］Blasi F，Tarsia P，Aliberti S.Chlamydophilapneumoniae［J］.Clin Microbiol Infect，2009，15（1）：29－35.DOI：10.1111/j.1469－0691.2008.02130.x

［5］Balin BJ，Gerard HC，Arking EJ，et al.Identification and localization ofChlamydiapneumoniaein the Alzheimer’s brain［J］.Med Microbiol Immunol.1998，187（1）：23－42.

［6］Gerard HC，Wildt KL，Whittum－Hudson JA，et al.The load ofChlamydiapneumoniaein the Alzheimer’s brain varies with APOE genotype［J］.Microb Pathog，2005，39（1/2）：19－26.DOI：10.1016/j.micpath.2005.05.002

［7］Gerard HC，Dreses－Werringloer U，Wildt KS，et al.Chlamydophila（Chlamydia）pneumoniaein the Alzheimer’s brain［J］.FEMS Immunol Med Microbiol，2006，48（3）：355－366.DOI：10.1111/j.1574－695X.2006.00154.x

［8］Little CS，Hammond CJ，MacIntyre A，et al.Chlamydiapneumoniaeinduces Alzheimer－like amyloid plaques in brains of BALB/c mice［J］.Neurobiol Aging，2004，25（4）：419－429.DOI：10.1016/S0197－4580（03）00127－1

［9］Hammond C，Little CS，Longo N，et al.Antibiotic alters inflammation in the mouse brain during persistentChlamydia pneumoniaeinfection［M］.In：Alzheimer’s disease：new advances.Bologna：Medimond International Proceedings，2006：537－540.

［10］Loeb MB，Molloy DW，Smieja M，et al.A randomized，controlled trial of doxycycline and rifampin for patients with Alzheimer’s disease［J］.J Am Geriatr Soc，2004，52（3）：381－387.DOI：10.1111/j.1532－5415.2004.52109.x

［11］Finefrock AE，Bush AI，Doraiswamy PM.Current status of metals as therapeutic targets in Alzheimer’s disease［J］.J Am Geriatr Soc，2003，51（8）：1143－1148.DOI：10.1046/j.1532－5415.2003.51368.x

［12］Cahoon L.The curious case of clioquinol［J］.Nat Med，2009，15（4）：356－359.DOI：10.1038/nm0409－356

［13］Albert NM.Inflammation and infection in acute coronary syndrome［J］.J Cardiovasc Nurs，2000，15（1）：13－26.

［14］Kovács T，Cairns NJ，Lantos PL.Olfactory centres in Alzheimer’s disease：olfactory bulb is involved in early Braak’s stages［J］.Neuroreport，2001，12（2）：285－288.

［15］Airenne S，Surcel HM，AlakärppäH，et al.Chlamydiapneumoniaeinfection in human monocytes［J］.Infect Immun，1999，67（3）：1445－1449.

［16］MacIntyre A，Abramov R，Hammond CJ，et al.Chlamydia pneumoniaeinfection promotes the transmigration of monocytes through human brain endothelial cells［J］.J Neurosci Res，2003，71（5）：740－750.DOI：10.1002/jnr.10519

［17］MacIntyre A，Hammond CJ，et al.Chlamydiapneumoniaeinfection alters the junctional complex proteins of human brain microvascular endothelial cells［J］.FEMS Microbiol Lett，2002，217（2）：167－172.

［18］Paradowski B，Jaremko M，Dobosz T，et al.Evaluation of CSF－Chlamydiapneumoniae，CSF－tau，and CSF－Abeta42 in Alzheimer’s disease and vascular dementia［J］.J Neurol，2007，254（2）：154－159.DOI：10.1007/s00415－006－0298－5

［19］Rasmussen SJ，Eckmann L，Quayle AJ，et al.Secretion of proinflammatory cytokines by epithelial cells in response toChlamydiainfection suggests a central role for epithelial cells in chlamydial pathogenesis［J］.J Clin Invest，1997，99（1）：77－87.DOI：10.1172/JCI119136

［20］Wood PL.Role of CNS macrophages in neurodegeneration［M］.In：Neuroinflammation Mechanisms and Management.New Jersey：Humana Press，1998：1－59.

［21］Boelen E，Steinbusch HW，van der Ven AJ，et al.Chlamydia pneumoniainfection of brain cells：Aninvitrostudy［J］.Neurobiol Aging，2007，28（4）：524－532.DOI：10.1016/j.neurobiolaging.2006.02.014

［22］Gérard HC，Fomicheva E，Whittum－Hudson JA，et al.Apolipoprotein E4 enhances attachment ofChlamydophila（Chlamydia）pneumoniaeelementary bodies to host cells［J］.Microb Pathog，2008，44（4）：279－285.DOI：10.1016/j.micpath.2007.10.002