LAMP技术在动物病毒病原检测中的应用进展

周广舟，徐苏丽，谭晓荣，陈小兵

2.郑州大学附属肿瘤医院，郑州 450008

1 引言

环介导等温扩增技术（Loop－mediated isothermal amplification，LAMP）是日本学者 Notmomi等［1］于2000年首先报道的一种新的核酸扩增技术。LAMP技术采用能特异识别靶序列上6个位点的4条引物及1种具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件（一般为60～65℃左右）下，1 h内其扩增效率可达到109～1010个数量级。区别于传统的PCR方法，LAMP技术不需要昂贵的PCR仪器，特异性强、等温灵敏、操作简单、扩增反应时间较短且易于观察结果，利于在基层实验室推广使用等优点，近来在各类医学病原包括病毒、细菌、真菌、支原体和寄生虫等传染性疾病的检测等领域得到了广泛的应用，在疫病诊断领域显示了广阔的应用前景。目前在医学（食品）微生物和寄生虫等领域的检测鉴定等方面已有较多的总结，如对日本血吸虫、副溶血弧菌等的检测［2－3］。本文主要就在临床和科研实践中利用基于LAMP的技术对各类医学病毒的检测及鉴定工作的报道做一综述。

2 LAMP技术在常见病毒病的检测应用

2.1 肝炎病毒 常见的如乙肝病毒和丙型肝炎病毒等均为常见的RNA病毒，可以通过血液和母婴传播等方式感染人而造成肝炎流行。临床上目前对这类病毒的针对往往采取传统的ELISA方法和套式RT－PCR等方法进行检测，但往往由于低特异性和易交叉污染，结果往往并不可靠，造成临床上的错检或漏检。李启明等［4］利用Reverse Transcription－LAMP（RT－LAMP）技术对60份经 Real－time PCR或RT－PCR验证阳性的血清样品进行检测，阳性符合率达98%，检测灵敏度可达到10个拷贝的RNA分子。Lan等［5］对68个包括粪便、血清、肝脏和胆汁等样品内的HEV病毒进行检测，检出限为0.045 fg，比巢式（nest）RT－PCR的灵敏度高100倍。近来，不同研究小组在对肝炎病毒的RT－LAMP检测上做了更多的探索和实践，使之检测更灵敏快速［6－7］。

2.2 流感病毒 流感是人类目前最重要的病毒性疾病之一，每年几乎全世界10%－20%的人口都会遭受到季节性流感的侵袭并造成大约50～100万人的死亡，带来巨大的经济负担。有效的流感病毒检测和疫苗接种是迅速建立人群免疫屏障、阻断流感大流行蔓延、减少和降低其危害性的有效手段。针对2009年大流行的H1N1流感病毒血凝素（HA）基因，Kubo等［8］建立了 HA基因的 RT－LAMP检测方法，检测限与Taq Man RT－PCR类似，达到目标RNA的10个拷贝/反应体系，260个样品中RTLAMP检测到136个阳性，灵敏度和特异性分别达到97.8%和100%。最近，Hatano等［9］对 H1N1流感病毒的RT－LAMP检测技术进行了新的改进和尝试，使之操作更方便，结果更精确。除此之外，一些科学家还相继建立了H5N1、H3型猪流感病毒等多株人兽（鸟）共感染病毒的RT－LMAP检测技术［10－11］，大大推动了对这些病原的鉴定及致病机制研究的进程。

2.3 艾滋病毒 Curtis等［12］设计了针对 HIV－1病毒的6个蛋白酶和p24基因的特异性引物，利用RT－LAMP技术直接检测细胞内和血清样品里的HIV－1病毒，结果显示在30 min内就可实现对HIV－1 DNA和RNA的检测，在60 min时间内每个反应体系的检测限为10和100个拷贝，并且不需要核酸提取步骤，节约了整个检测时间。最近，该研究小组又建立了针对HIV－1特异性序列片段检测的 RT－LAMP 技 术［13］。Hosaka等［14］也 建 立 了 类似的针对HIV－1病毒pol整合酶基因的快速一步RT－LAMP检测技术。

2.4 狂犬病毒 狂犬病是迄今为止人类唯一病死率高达100%的急性传染病，由狂犬病病毒引发的人与温血动物的一种急性、致死性的自然疫源性疾病。但由于狂犬病毒往往是较长的潜伏感染状态，易造成检测不及时而未采取治疗措施引起死亡。国外对狂犬病毒的RT－LAMP检测鉴定工作在2009年就已开始有报道［15－16］。在国内，许丹等［17］针对狂犬病毒I型核蛋白（N）保守区设计了4条识别靶序列上6个位点的特异性引物，建立了该病毒的LAMP检测方法，结果显示，病毒基因的最低检出量可达到10个拷贝数，反应特异性较强，已用于狂犬病毒的实验室检测和临床初步诊断。最近，黄元等［18］就狂犬病毒大转录酶蛋白基因（L）的高度保守区设计引物，同样成功建立了该病毒的快速一步式RT－LAMP检测方法，灵敏度比RT－nest PCR高10倍以上，取得了较好的检测效果。

2.5 单纯疱疹病毒 单纯疱疹病毒（HSV）是一类能引起皮肤病和性病的常见病原体，常见的有I型和II型两个血清型，其中I型HSV在成年人血清中阳性率高达85%以上，感染后引起人的疱疹性角膜炎、口唇疱疹、皮肤疱疹等。常用的血清学检测、病毒分离培养或PCR检测方法往往费时繁琐或需昂贵的仪器而不能大规模推广，限制了这些技术的应用。周支香等［19］提取HSV－2病毒基因组后，设计了4条针对病毒糖蛋白基因的LAMP引物，建立了检测HSV病毒的LAMP技术，检测HSV－2的敏感性可达到0.01 ng/μL。彭丁晋等［20］利用 LAMP技术检测了3例具HSV－1感染的临床样本，同样显示了较好的检测效果。

2.6 冠状病毒 最具代表性的例子是已建立的针对的严重急性呼吸综合征病毒SARS－Co V的LAMP检测技术。Hong等［21］在2003年SARS流行期间搜集的49个病人的口漱液、咽拭子和鼻咽拭子样品中，RT－LAMP的检测限为0.01PFU，灵敏度比传统的RT－PCR高100倍，并且大多在不到1 h内完成检测，最快的只有11 min。此后，Poon等［22］还建立了新的 Real－time LAMP 技术来 检 测SARS－Co V，比较了传统的荧光定量PCR技术同LAMP技术的检测灵敏度差异，结果显示并没有明显的分别，提示LAMP技术可以做为一个实用简便的检测手段进行大规模应用。目前，其它一些冠状病毒的LAMP检测方法也相继建立起来［23－24］。

2.7 登革病毒 登革病毒（Dengue virus，DEN）是登革热、登革出血热/登革休克综合征（DHF/DSS）的病原体，广泛流行于全球热带及亚热带的国家和地区，已造成这些地区严重的公共卫生问题。为了快速检测和区分登革病毒血清型，Parida等［25］建立了一步法实时定量血清型特异性RT－LAMP检测方法，分别用实时浊度仪监测、琼脂糖凝胶电泳、自然光和紫外光下肉眼观察SYBR GreenI颜色变化判定结果。对总共63例临床诊断病人和疑似病例血清样本的检测中发现，RT－LAMP的检测灵敏度为100%，同比RT－PCR和病毒培养法检测提高13%和19%，而且特异性也较高，能够确定不同血清型的登革病毒。

2.8 乙脑病毒 流行性乙型脑炎病毒，简称为乙脑病毒，本病毒首先于1953年在日本从患者脑组织中分离获得，又称为日本乙型脑炎（Japanese encephalitis virus，JBE）属于虫媒病毒黄病毒科黄病毒属，蚊是其传播的媒介和贮存宿主。不同的研究小组早在2006年就分别独立地建立了针对JEV病毒的RT－LAMP检测方法，并显示有较好的诊断效果［26－27］。最近，Chen等［28］就 RT－LAMP 诊断方法同传统RT－PCR和荧光定量PCR检测方法进行了比较分析。结果显示RT－LAMP的检测灵敏度同荧光定量PCR相当，但是传统RT－PCR的10倍，检测限达到24拷贝/微升。交叉检测也表明RTLAMP技术的特异性也较高，同登革2型病毒、狂犬病毒、诺如病毒、星状病毒和人肠道71型病毒均无交叉反应，表明RT－LAMP技术可以作为临床分子水平检测的重要工具用于乙脑病毒的诊断。而Perera等［29］利用 RT－LAMP技术筛查携带病毒的蚊虫也取得了很好的效果，以整个蚊体为模板在30min内就可以快速简便地鉴定是否为携毒蚊。

2.9 其它病毒 近年来，学者们对其它的一些不常见的医学病毒也陆续建立了类似的LAMP检测方法用于病毒的鉴定和病例的诊断，如风疹病毒［30］、诺如病毒［31］、嗜 T 淋巴细胞病毒（HTLV）［32］、柯萨奇病毒［33］等，在特异性和灵敏度上都具很高的水平。

3 展 望

当前，诸如SARS、人感染高致病性禽流感、新型H1N1流感等一些新发病毒性传染病疫情不断出现，对社会公众健康造成了严重损害。对这些影响大的传染病疫情，快速、准确地做出病原学诊断是及时有效控制疫情，将损害降到最低限度的保证。作为一种快速、简便、灵敏、特异，无需贵重检测设备而易普及的检测技术，LAMP诊断方法将在很大程度上发挥重要的作用。它的整个过程均在恒温条件下进行，避免了常规PCR对于温度循环的特殊要求所带来的各种不便。虽然对于某些病毒的检验，LAMP的灵敏度和特异性尚未超越荧光定量PCR等方法，但在很大程度上LAMP已经符合了临床所需的要求。

但LAMP检测技术同样存在一些不足，主要体现在：LAMP检测阳性反应呈现梯度条带，不像PCR呈现单带，一旦产生非特异性扩增则不易鉴别。此外，由于反应灵敏度高，外界物质的介入很容易造成假阳性，尤其要防止电泳过程中气溶胶的污染。但是，随着LAMP技术的不断发展完善，必将在检验检疫乃至整个生物学检测领域占有一席之地，特别是在一些基层实验室、床边检测和流行病学调查等领域具有广阔的应用前景。

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